苯乳酸与有机酸联用对食源性致病菌联合抑菌效应及作用机理

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苯乳酸(PLA)为近年发现的一种新型天然抑菌物质,具有广谱抑菌活性,可由乳酸菌代谢产生。然而,苯乳酸在使用过程中存在抑菌活性不高、使用剂量较大的问题,限制了其商业化的应用。实验室前期研究发现食品体系中苯乳酸与乳酸等有机酸共存会显著提高其抑菌活性,然而苯乳酸与有机酸的联合抑菌效应及作用机制尚未明确。因此,本研究考察了苯乳酸与有机酸的联合抑菌效应,以期筛选与苯乳酸有协同抑菌作用的有机酸,并考察苯乳酸与有机酸的协同抑菌机理,为苯乳酸在食品防腐中的应用提供理论依据。本文选择乳酸菌代谢的主要有机酸乳酸、醋酸、柠檬酸、丁酸、琥珀酸、苹果酸、丙酸、酒石酸、草酸等为研究对象,全面考察了苯乳酸与各有机酸对Listeria monocytogenes、Staphylococcus aureus、Escherich coli、Salmonella typhimurium的最小抑菌浓度(MIC)。苯乳酸对各指示菌的MIC在1.25~2.5 mg/mL范围内,而有机酸对各指示菌的MIC在0.5~2.5 mg/mL,其中醋酸对大肠杆菌的最小抑菌浓度能低至0.5mg/mL。苯乳酸与各有机酸联用对各指示菌的联合抑菌效应的研究结果是苯乳酸与醋酸、琥珀酸、苹果酸联用对4种指示菌均产生协同抑菌效应,与乳酸、柠檬酸、丁酸、酒石酸联用则会对3种指示菌产生协同抑菌作用。以L.monocytogenes作为革兰氏阳性菌指示菌,分别从细胞膜、DNA和蛋白质表达等方面考察了苯乳酸与乳酸和醋酸联用的协同抑菌机制。协同组合的苯乳酸与乳酸和醋酸对L.monocytogenes细胞凋亡的影响研究结果显示,有机酸联用会造成80%以上的细胞凋亡,且体现协同效果;苯乳酸与乳酸、醋酸均可显著改变L.monocytogenes Zeta电位,使菌体表面电荷由负变为正;以DiSC3(5)作为研究跨膜电势的荧光探针,考察了苯乳酸与乳酸、醋酸联用对L.monocytogenes跨膜电势的影响,结果显示苯乳酸与乳酸、醋酸联用会消散细胞膜电位,从而消耗跨膜电势;同时,以SYTO-9和PI荧光探针研究了苯乳酸与乳酸、醋酸对细胞膜渗透性的影响,荧光显微镜结果显示经各有机酸处理,膜渗透性遭到显著破坏,流式细胞术结果显示苯乳酸与乳酸和醋酸联用对细胞膜渗透性发挥协同破坏效应;TEM结果显示苯乳酸与乳酸、醋酸联用会使L.monocytogenes细胞密度降低,但细胞膜未出现严重破坏。DNA方面,凝胶阻滞电泳条带的弥散说明苯乳酸与乳酸、醋酸联用会使DNA发生降解,DAPI探针标记实验显示各有机酸在菌体内会影响DNA合成。蛋白质表达方面,SDS-PAGE电泳结果出现了蛋白条带的增加、消失、颜色变深和变浅等实验现象,推测苯乳酸与乳酸、醋酸联用会影响L.monocytogenes菌体蛋白质的表达。以E.coli作为革兰氏阴性菌指示菌,分别从细胞膜、DNA、蛋白质等方面考察了苯乳酸与乳酸、醋酸协同组合对E.coli抑菌机理。结果表明苯乳酸与乳酸、醋酸联合作用于E.coli,细胞凋亡率均低于30%;苯乳酸与乳酸、醋酸均能显著改变菌体表面电荷,其中苯乳酸与乳酸有机酸联用对Zeta电位呈显著的协同效应;对E.coli质子动势影响的研究结果显示,苯乳酸、乳酸、醋酸均会消散跨膜电势,且联用时体现协同作用效果;以PI和SYTO-9荧光探针标记流式细胞术结合荧光显微镜观察研究各协同有机酸组合对E.coli细胞膜渗透性的影响,结果表明各有机酸单独使用与联用均对细胞膜渗透性改变较小,但有机酸联用仍呈协同效应;TEM实验结果显示苯乳酸与乳酸、醋酸联用对E.coli细胞质内溶物破坏较严重,但未对细胞膜完整性有显著性破坏。DNA方面,凝胶阻滞电泳结果表明苯乳酸与乳酸会使DNA条带呈现亮度降低,条带弥散,DAPI探针标记考察体内DNA合成量的实验结果显示有机酸联用会使DNA的合成量减少,且苯乳酸与乳酸、醋酸体现协同作用效果。经各有机酸处理4 h后,E.coli菌体蛋白质在种类和数量上未产生显著变化,故推测苯乳酸与乳酸、醋酸联用对蛋白质种类和数量未产生影响。
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