论文部分内容阅读
研究背景及目的如今,慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)患者大多数均不可避免地发展至终末期肾脏病(End Stage Renal Disease,ESRD),并且需要接受肾脏替代治疗。腹膜透析(Peritoneal Dialysis,PD)是当前主要的肾脏替代治疗方式之一。腹膜炎是腹膜透析常见严重并发症,也是腹膜透析失败的主要原因。慢性肾脏病会引起肠道菌群失调,导致肠道黏膜屏障破坏,使肠道菌群毒性代谢产物移位进入血液循环,引起系统性炎症。肠道菌群代谢产物氧化三甲胺(Trimethylamine N-Oxide,TMAO)属于小分子毒素,当人体摄入富含卵磷脂、胆碱的食物,肠道菌群将这些营养物质代谢为TMA并在肝脏FMO3下转化为TMAO。因TMAO主要经肾脏排泄,在终末期肾脏病患者中,血浆TMAO浓度较普通人群显著升高,对机体产生毒性作用。目前研究较多的是TMAO对动脉粥样硬化及心血管疾病的作用,但是TMAO对腹膜炎症的作用并没有明确地阐述。因此,本文旨在探讨TMAO在腹膜透析相关腹膜炎中的作用及发生机制。研究方法及内容1.临床研究:收集我院2016年-2018年共144名腹膜透析患者的血清及腹透液标本,检测血生化、血清和腹透液中TMAO水平、腹透液中IL-6、PAI-1、CA125水平。2.体内实验:采用5/6肾切除法构建大鼠慢性肾衰竭模型。实验分为sham组、5/6Nx+2.5%葡萄糖腹透液(5/6Nx+2.5%G)组、5/6Nx+2.5%葡萄糖腹透液+TMAO 20mg/kg/d(5/6Nx+2.5%G+TMAO)组、5/6Nx+4.25%葡萄糖腹透液组(5/6Nx+4.25%G)组。持续给药6周后处死大鼠,留取壁层腹膜做H&E染色,免疫组化检测CD68、CD3及MPO表达。留取脏层腹膜通过Real-Time PCR和Western Blot 检测 IL-6、MCP-1、IL-1β、NLRP3 和磷酸化 NF-κB p65 的 mRNA和蛋白表达。3.体外实验:(1)提取大鼠原代腹腔巨噬细胞,LPS预处理1h,予不同浓度梯度TMAO(0,50,100,200μM)刺激培养24h,收集细胞。Western Blot检测磷酸化NF-κB p65,NLRP3和Caspase-1的蛋白表达。细胞免疫荧光观察巨噬细胞中磷酸化p65入核情况。(2)传代培养腹膜间皮细胞HMrSV5,LPS预处理1h,予不同浓度梯度TMAO(0,50,100,200μM)刺激培养24h,收集细胞。流式细胞术和LDH释放实验检测腹膜间皮细胞的坏死率。Western Blot检测焦亡关键蛋白NLRP3,Caspase-1,IL-1β和GSDMD的蛋白表达。研究结果1.临床研究:腹膜 Kt/V(r=-0.21,P=0.010),残余肾 Kt/V(r=-0.35,P=0.000)和总Kt/V(r=-0.42,P=0.000)与TMAO水平负相关。血清肌酐、尿素氮、β2-微球蛋白(r=0.25,P=0.009)和C-反应蛋白(r=0.23,P=0.014)浓度与TMAO水平正相关。血清TMAO浓度与腹透液中IL-6浓度(r=0.22,P=0.022)、PAI-1浓度(r=0.21,P=0.028)正相关,与CA125浓度(r=-0.22,P=0.021)负相关。高水平TMAO与腹透患者较高死亡率和腹膜炎发生率相关。2.体内实验:HE染色可见5/6Nx+2.5%G+TMAO组与sham组和5/6Nx+2.5%G组比较,间皮细胞脱落明显,间质可见大量炎症细胞浸润。免疫组化可见5/6Nx+2.5%G+TMAO组CD68+、CD3+、MPO+细胞均显著增加(P<0.01)。5/6Nx+2.5%G+TMAO 组 IL-6(P<0.01)、MCP-1(P<0.01)、IL-1β(P<0.01)、NLRP3(P<0.01)、磷酸化 NF-κB p65(P<0.01)在mRNA和蛋白水平均显著升高。3.体外实验:(1)在LPS诱导大鼠原代腹腔巨噬细胞中,IL-6、MCP-1、IL-1β mRNA和蛋白表达水平呈TMAO浓度依赖显著升高(P<0.01);磷酸化NF-κB p65及NLRP3和Caspase-1的蛋白表达水平亦呈TMAO浓度依赖显著升高(P<0.05)。细胞免疫荧光显示LPS+TMAO组细胞中磷酸化p65入核比例比LPS组显著增高(P<0.01)。(2)在LPS诱导腹膜间皮细胞中,流式细胞术和LDH释放实验可见LPS+TMAO组比LPS组细胞坏死率(%)显著升高(P<0.01);NLRP3,Caspase-1,IL-1β 和 GSDMD 蛋白表达水平随着TMAO浓度的增加先逐渐升高后降低,在100μM TMAO刺激时升高最显著(P<0.05)。结论氧化三甲胺(TMAO)促进LPS诱导的腹腔巨噬细胞NF-κB炎症信号通路及NLRP3炎症小体活化,促进LPS诱导的腹膜间皮细胞焦亡,从而加重腹膜炎症。