活络效灵丹对动脉粥样硬化模型细胞作用的研究

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目的:  活络效灵丹作为中医药方中活血化瘀的代表方之一,最初由清代名医张锡纯创造并收录于其具代表性的著作《医学衷中参西录》,具有活血消肿,通络止痛,祛瘀通经的功效,主治:气滞血瘀,心腹疼痛,腿臂疼痛,跌打瘀肿,内外疮疡,以及症瘕积聚等。一直以来为后世用于周身疼痛疾病的治疗,在现代临床疾病中主要用于颈肩腰腿疼痛的治疗,还可以缓解心腹疼痛,即现在临床冠心病心绞痛、脑血栓、动脉粥样硬化等等,其中其抗动脉粥样硬化的研究有待我们进一步的研究。近几年来,我国在中医药研究方面就抗动脉粥样硬化及稳定斑块这一问题采取了一些积极的探索。本研究旨在用westernblot及生化检测阐明活络效灵丹含药血清对小鼠动脉粥样硬化细胞的作用,探讨活络效灵丹含药血清对CD36、SR-A蛋白的表达及胆固醇含量的影响。  方法:  运用不同浓度氧化低密度脂蛋白作用于小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7,通过油红O染色,胆固醇酶法法及MTT法检测结果,摸索出动脉粥样硬化细胞转化程度最高的浓度。运用水提醇沉法提取活络效灵丹,提取物灌胃大鼠后提取含药血清,于56℃灭活30分钟,微孔滤膜过滤去除血清中的菌类,于-80℃冰箱保存待用。细胞分组:空白对照组、模型对照组、活络效灵丹高、中、低剂量组、阳性对照组(20%空白含药血清作用于空白对照组及模型对照组细胞,20%辛伐他丁含药血清作用于阳性对照组细胞,20%活络效灵丹含药血清作用于活络效灵丹高剂量组细胞,10%活络效灵丹含药血清作用于活络效灵丹中剂量组细胞,5%活络效灵丹含药血清作用于活络效灵丹低剂量组细胞),通过westernblot检测细胞内CD36蛋白、SR-A蛋白及胆固醇酶法检测细胞内胆固醇含量的变化。探讨活络效灵丹含药血清对小鼠动脉粥样硬化细胞的具体作用。  结果:  油红O染色显示,RAW264.7细胞内未见或可见极少量脂滴,浓度为10~40mg/Lox-LDL诱导的泡沫细胞内可见少量脂滴,与RAW264.7细胞组(ox-LDL浓度为0mg/L组)比较脂滴增多,而浓度为50mg/Lox-LDL诱导的泡沫细胞脂滴明显增多,脂滴大部分聚集在细胞膜的内侧,浓度为60、70及80mg/Lox-LDL诱导的泡沫细胞形状不规则,边界模糊,且细胞大多已破裂凋亡,脂滴散布于培养基中。  MTT实验结果显示,随着作用于RAW264.7细胞的ox-LDL浓度的不断增高泡沫细胞存活率呈现逐渐降低的趋势。与ox-LDL浓度为0mg/L的组相比,ox-LDL浓度为60mg/L时,细胞的存活率显示出现明显的下降趋势,当ox-LDL(氧化低密度脂蛋白)浓度大于70mg/L时各组细胞存活率下降趋势突出。  胆固醇酶法检测结果显示,RAW264.7细胞内胆固醇酯的比重小于60%,当用浓度为40mg/L和50mg/Lox-LDL诱导细胞24h,诱导得细胞内胆固醇酯比重分别为56.95%±4.33%和60.28%±2.67%,细胞泡沫化程度高,而10~30mg/L诱导的细胞不具备泡沫细胞的标准特征,细胞泡沫化程度低,大于60mg/L诱导的泡沫细胞,其泡沫化程度严重,细胞形状不规则,边界模糊,贴壁不牢,绝大多数的细胞破裂或凋亡,脂滴外泄散布于细胞培养基中。  Westernblot结果显示,与空白对照组相比,模型对照组CD36蛋白、SR-A蛋白表达明显升高;与模型对照组相比,活络效灵丹含药血清高中低剂量组及阳性对照组CD36蛋白、SR-A蛋白含量明显降低;与活络效灵丹含药血清高中低剂量组相比,阳性对照组CD36蛋白、SR-A蛋白含量明显降低;活络效灵丹低、中、高剂量组CD36蛋白、SR-A蛋白含量呈现逐渐下降的趋势。  胆固醇酶法结果显示,与正常对照组相比,模型对照组胆固醇酯比重明显升高;与模型对照组相比,活络效灵丹含药血清高中低剂量组及阳性对照组胆固醇酯比重明显降低;与活络效灵丹含药血清高中低剂量组相比,阳性对照组胆固醇酯比重明显降低;活络效灵丹低、中、高剂量组胆固醇酯比重呈现逐渐下降的趋势。  结论:  活络效灵丹含药血清能够明显抑制由动脉粥样硬化引起的CD36蛋白、SR-A蛋白的高表达及胆固醇含量的升高,说明活络效灵丹含药血清对动脉粥样硬化起到治疗的作用。活络效灵丹含药血清抗动脉粥样硬化的保护作用,与活络效灵丹能够抑制CD36蛋白、SR-A蛋白及胆固醇含量有关。
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