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为探讨昆虫食性与其肠道微生物群落可能的关系,本研究采用基于16SrDNA-DGGE指纹图谱和文库分析的非培养手段,对鳞翅目棉铃虫和家蚕,以及等翅目台湾乳白蚁的肠道微生物区系分别进行了研究。同时,对于有生产实践利用价值的白蚁,初步从安徽、上海、湖南、云南的几种鼻白蚁科和白蚁科白蚁种类中通过比较几种纤维素酶活性,筛选出黑胸散白蚁并对其建立cDNA表达文库,发掘真核纤维素酶基因。主要研究结果如下:
1.选择棉铃虫Helicoverpa armigera的野外种群和室内种群幼虫,比较其肠道细菌群落的异同。16S rDNA的变性梯度凝胶电泳和文库序列分析两种手段得到的关于细菌群落结构和多样性格局的结果较为相似。研究结果表明,两个种群中肠中都存在某些特殊的细菌类型,野外种群中肠细菌群落多样性更为丰富。实验室种群中肠细菌群落比较简单,属于Enterococcus的系统发育型占优势,占84%。而野外种群的Enterococcus只占28%,其余类群的比例分别是:Lactococcus,11%;Flavobacterium,10%;Acinetobacter,19%;Stenotrophomonas,10%。这些类群都属于优势菌群。研究结果暗示环境和食料可能影响肠道微生物结构。
2.对于家蚕Bombyx mori,选择两种不同品系——专食性品系c108和广食性品系SCN2幼虫,试图探讨品系和食料对中肠内的细菌群落多样性的影响。文库序列分析表明16S rDNA基因代表了家蚕中肠内的41种系统发育型(phylotype),大多数属于Proteobacteria,其次是Lactobacillales。此外,还有少数属于Deinococcus-Thermus、Bacillales、Clostridiales、Actinobacteria,尚有5种系统发育型不能确定其所属类型。家蚕的这两种品系中,肠球菌属.Enterococcus是其中肠细菌的优势菌群,栖热菌属Thermus是次优势菌群。优势菌肠球菌属Enterococcus的组成在品系和不同食料喂养条件下有着一定的变化,无桑饲料喂养条件下SCN2品系中肠内还出现了新的次优势菌葡萄球菌Staphylococcus。DGGE图谱显示家蚕低龄幼虫和高龄幼虫肠道细菌格局存在差异,推测可能与其发育期生理状态的差异有关。研究结果暗示家蚕特殊的食性可能与肠道特殊菌群的出现有一定的关系。食料改变,生长受阻后肠道微生态平衡的也发生变化。
3.对于台湾乳白蚁Coptotermes formosanus两种食性不同的品级——工蚁和兵蚁肠道微生物群落,DGGE和克隆文库分析结构都表明,拟杆菌门的系统发育型在两种品级中都是优势菌。文库分析显示工蚁和兵蚁在拟杆菌门Bacteroidetes和螺旋体门Spirochaete的结构组成上存在显著差异。相较于工蚁,兵蚁肠道拟杆菌门的多样性和比例相对少,而螺旋体门则有所增加。DGGE图谱发现了工蚁特异性条带,属于拟杆菌门和螺旋体门。纤维素酶活性分析显示工蚁肠道匀浆物的纤维素酶活性显著高于兵蚁。工蚁匀浆物加入沼气系统比加入兵蚁或对照,总产气量、产甲烷量都有显著的增加。研究结果暗示台湾乳白蚁这两种品级间,食性的差异,纤维素酶活性的差异以及对沼气系统产气量影响的差异可能与肠道微生物结构差异有着一定的联系。
4.不同地区白蚁纤维素酶活性的调查结果显示,除了β-葡萄糖苷酶,各种酶活力(滤纸酶活、微晶纤维素酶活、内切葡聚糖酶活性、外切葡聚糖酶、木聚糖酶)躯干部活性都高于头部。以滤纸酶活作为衡量降解纤维素的综合指标,散白蚁属的某些种类具有较高的酶活力。高等白蚁中某些种类的β-葡萄糖苷酶、外切酶活力也较高。通过cDNA表达文库的表型筛选,发现具有内切葡聚糖酶活性和β-葡萄糖苷酶活性的重组子。通过测序确认克隆到一个编码内切葡聚糖酶的基因,属于GHF9,可能是来自白蚁自身的纤维素酶基因。