【摘 要】
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目的:研究蛋白激酶C的亚型PKCδ在大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)中的表达,通过观察脂多糖(LPS)诱导的RPMVEC损伤时PKCδ表达的变化,以及PKCδ抑制剂楸毒素(Rottlerin)对单层通透
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目的:研究蛋白激酶C的亚型PKCδ在大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)中的表达,通过观察脂多糖(LPS)诱导的RPMVEC损伤时PKCδ表达的变化,以及PKCδ抑制剂楸毒素(Rottlerin)对单层通透性增高的干预作用。探讨PKC特异性亚型在LPS诱导的RPMVEC损伤中的作用。 方法:在体外分离、培养的RPMVEC的基础上进行PKCδ的Western印迹和免疫组化检测,以及LPS作用后PKCδ表达的变化。用针头式滤器检测LPS及LPS+Rottlerin干预后RPMVEC单层滤过系数(Kf)的变化。 结果1 体外成功分离培养RPMVEC,经形态学、Ⅷ因子相关抗原及FITC-BSI结合实验证实所获得为RPMVEC;在细胞传代时采用含有EDTA的胰蛋白酶,缩短了消化传代的时间,减少了传代过程中胰蛋白酶对细胞的损伤;成功进行了细胞的冷冻和复苏,为今后的实验打下基础。2 首先通过采用免疫组化的方法明确了PKCδ在RPMVEC中有广泛的表达,其表达部位位于胞浆。Western印迹检测PKCδ出现一条蛋白印迹条带,分子质量与蛋白质分子质量Mark相比,约为77KD,进一步证实了PKCδ在RPMVEC中存在。采用10μg/ml LPS作用RPMVEC 60min后与正常对照组比较,PKCδ表达明显增高。3 10μg/mlLPS、5μM/L Rottlerin分别作用15、30、60、90、120min,LPS组RPMVEC单层的Kf值较对照组显著增高,Rottlerin组较对照组无明显差异。Rottlerin+LPS组各时相点Kf值显著低于LPS组。 结论:1 成功进行原代培养RPMVEC,形态学、Ⅷ因子相关抗原及FITC-BSI结合实验证实所获得为RPMVEC、并在对传代方法改进后成功对细胞进行冷冻和复苏。2 采用免疫组化的方法证实了PKCδ在RPMVEC中有表达,其表达部位在细胞浆;LPS可导致RPMVEC表达PKCδ增高。3 采用PKCδ特异性抑制剂Rottlerin可部分抑制LPS导致的RPMVEC单层通透性增高,LPS导致RPMVEC单层通透性增高的机制可能为激活了细胞内的PKC途径。
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