周围神经(peripheral nerve, PN)损伤后的再生,特别是缺损的修复一直是临床上一大难题。对于短的周围神经缺损可以直接缝合,而长段的神经缺损常用的治疗方法是自体神经移植。但供移植的神经为皮神经,其直径小,膜管小,直径粗的运动神经轴索难以长入,神经功能恢复不全,不能满足临床神经移植的需要,自体神经移植会给供区带来永久性神经功能障碍。因此,研发能够有效代替自体神经的移植的替代物是目前亟待解决的难题。近年来,随着组织工程的兴起,组织工程化神经已成为目前研究的焦点。应用组织工程学方法制备组织工程支架材料接长节段神经缺损收到较好疗效,受到了越来越多的关注。支架材料的组成及内部微结构是影响组织工程移植物修复长节段神经损伤的关键因素。鉴于正常神经基底膜微管结构引导再生神经轴突定向生长的关键作用,如果支架材料具备正常神经组织的特性,将会成为最理想的移植替代修复材料。本实验分两部分。第一部分:三种化学方法制备脱细胞神经的比较目的通过对三种化学脱细胞法制备脱细胞神经的比较,选择一种最合适的脱细胞神经制备方法。方法1、分别用溶血软卵磷脂法、用三硝基甲苯和脱氧胆酸钠溶液在室温下交替处理法以及用叠氮钠、三硝基甲苯、脱氧胆酸钠溶液顺序处理法处理SD大鼠坐骨神经,制备脱细胞神经;2、通过石蜡切片对这三种脱细胞材料进行形态学评价;3、对这三种材料进行生物相容性评价。结果1.三种脱细胞神经支架直径和长度无明显变化,质软而有韧性、乳白色、半透明,弹性较新鲜神经组织略差,韧性比新鲜神经略强,延展性较萃取前略增加,可在无张力条件下行常规的神经吻合。2. HE染色Dumont萃取法横切片上可见到轴突细胞溶解碎片,细胞萃取不彻底,红染的雪旺细胞基底膜(schwann cell basilar membrane SCBM)形成的不规则圆形空腔。纵切片上,红染的SCBM呈波浪状纵形排列,轴突、髓鞘结构消失而形成管柱状空隙; Sondell法在横切片中红染的SCBM圆形空腔间出现了大的空隙,纵切片中红染的SCBM管形间出现了大的空隙;而Haase法在纵、横切片上, SCBM的排列均匀一致,均未出现大空隙。3.层粘蛋白免疫组化染色:Dumont法横切片上黄染的SCBM被保留,围绕着空的神经内膜管。在纵切片上可见正常神经结构消失,而黄染的SCBM则被保留,呈波浪状纵形排列。Sondell法在横切片上可见神经组织髓鞘结构消失,黄染的SCBM形成不规则的圆形空腔。纵切面可见大的空隙。Haase法在横切面可见圆形和椭圆形的管状结构,髓鞘结构消失,黄染的SCBM形成规则的圆形空腔。纵切面可见管壁连续,未见明显塌陷。4.体外细胞毒性试验: MTT比色方法显示三组萃取的神经支架材料细胞毒性均为0级。直接接触法显示细胞毒性:Haase法优于Sondell法,而Sondell法优于Dumont法。5.植入后局部反应实验:炎症细胞反应程度指标显示1、2、4周,Haase法炎症反应程度明显低于Dumont及Sondell法:而Sondell法则优于Dumont法。纤维囊腔形成程度指标显示Haase法稍优于Sondell法;而Sondell法则明显优于Dumont法。结论通过对这三种脱细胞材料形态学评价、体外细胞毒性和植入后局部反应试验,证实了Haase法优于Dumont法及Sondell法。第二部分:新型神经支架材料的制备目的制备出一种新型的神经支架材料。方法1、选择Haase萃取法对枪乌贼神经进行脱细胞处理。2、通过石蜡切片对枪乌贼脱细胞神经材料进行形态学评价;3、对枪乌贼脱细胞神经材料进行生物相容性评价。结果从形态学和相容性两方面综合评价本支架桥材料,证实本支架材料具有良好的生物安全性,可用于体内移植修复。结论以枪乌贼神经经Haase萃取法制备出的新型人工神经支架材料,具有更好的生物稳定性和生物相容性,为神经组织工程领域提供了一种具有应用潜力的材料。