【摘 要】
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研究背景足细胞损伤是出现蛋白尿的重要原因,也是多种慢性肾脏病的共同发病机制。足细胞骨架蛋白synaptopodin是一种与肌动蛋白微丝紧密相连的富含脯氨酸的线状蛋白质,是足细胞分化成熟的标志。synaptopodin的突变或缺失可以导致足细胞结构的改变,引起蛋白尿和肾小球硬化的发生。但目前对于synaptopodin的调控机制仍然不是很清楚。Sos2是鸟苷酸交换因子Sos（Son of Seven
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（编号:81370808、81670656）；
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研究背景足细胞损伤是出现蛋白尿的重要原因,也是多种慢性肾脏病的共同发病机制。足细胞骨架蛋白synaptopodin是一种与肌动蛋白微丝紧密相连的富含脯氨酸的线状蛋白质,是足细胞分化成熟的标志。synaptopodin的突变或缺失可以导致足细胞结构的改变,引起蛋白尿和肾小球硬化的发生。但目前对于synaptopodin的调控机制仍然不是很清楚。Sos2是鸟苷酸交换因子Sos（Son of Sevenless）的一种亚型,研究表明Sos2与EPS8、E3b1形成的复合物对细胞骨架蛋白具有调控作用。然而,Sos2在足细胞中的表达及效应尚无报道。本研究拟探讨Sos2在足细胞中的表达及效应,并进一步探究其机制是否与调控足细胞骨架蛋白synaptopodin 有关。方法（1）利用全基因组二代测序检测发现某家族性肾脏病患者Sos2基因发生纯合突变,通过免疫荧光染色证实纯合突变基因的表达情况;（2）通过免疫荧光染色观察Sos2在不同类型的肾小球疾病患者的足细胞的表达情况;（3）体外培养的足细胞,分别给予 Ionomycin（2μM）处理 24h、ADR（0.25μg/ml）处理 24h、LPS（100μg/ml）处理48h,通过实时荧光定量PCR、western blot以及免疫荧光染色检测Sos2的表达;（4）沉默足细胞中的Sos2,通过实时荧光定量PCR及western blot验证Sos2-siRNA的沉默效率,通过western blot及免疫荧光染色检测足细胞的骨架蛋白synaptopodin、F-actin的表达;（5）过表达足细胞中的Sos2,通过实时荧光定量PCR及western blot验证Sos2腺病毒过表达的效率,通过western blot及免疫荧光染色检测synaptopodin、F-actin的表达;（6）调控足细胞中Sos2的表达,通过实时荧光定量PCR检测synaptopodin的mRNA的表达情况,通过western blot检测ssynaptopodin的降解情况;（7）通过免疫荧光染色检测正常小鼠肾组织中Sos2的表达情况,通过免疫共沉淀实验检测正常小鼠肾皮质、正常足细胞与ADR（0.25μg/ml）处理24h的足细胞、共同转染Flag-Sos2与 HA-synaptopodin 的HEK-293 细胞,Sos2 与 synaptopodin 的相互作用情况。结果（1）与正常肾组织相比,在Sos2基因纯合突变的某家族性肾病患者的肾小球Sos2表达明显减少;（2）与正常肾组织相比,MCD、FSGS、MN患者肾小球足细胞的Sos2表达明显减少;（3）足细胞在Ionomycin、ADR、LPS刺激后,Sos2在mRNA及蛋白水平表达均明显降低;（4）沉默Sos2,足细胞的骨架蛋白synaptopodin表达减少,F-actin骨架紊乱;（5）过表达Sos2延缓了 ADR损伤刺激引起的骨架蛋白synaptopodin表达减少,F-actin骨架紊乱;（6）沉默或者过表达Sos2,足细胞synaptopodin在mRNA水平无明显变化;沉默Sos2,synaptopodin的降解增加,过表达Sos2延缓了 ADR引起的synaptopodin的降解（7）Co-IP结果显示:在正常小鼠肾皮质、正常足细胞、共同转染Flag-Sos2与HA-synaptopodin 的 HEK-293 细胞,Sos2 与 synaptopodin 存在直接结合,在 ADR刺激后结合减少。结论Sos2通过直接和synaptopodin结合,稳定synaptopodin不被降解保护足细胞。
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