【摘 要】
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耳蜗能够将声音信号转换为神经电信号,上传至听觉核团从而产生听觉,其中毛细胞和螺旋神经节细胞是这种机电转化和传导作用的重要功能细胞,这类功能细胞的丢失、缺血或者功能障碍均会导致听力的损失。已有研究表明庆大霉素作为氨基糖苷类药物发挥治疗作用的同时,同样会作用到耳蜗内的相关功能细胞而产生大量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),造成线粒体的功能紊乱,引发细胞的凋亡或程序性细
【基金项目】
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国家自然科学基金项目31500841; 广东省自然科学基金项目2017A030313178;
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耳蜗能够将声音信号转换为神经电信号,上传至听觉核团从而产生听觉,其中毛细胞和螺旋神经节细胞是这种机电转化和传导作用的重要功能细胞,这类功能细胞的丢失、缺血或者功能障碍均会导致听力的损失。已有研究表明庆大霉素作为氨基糖苷类药物发挥治疗作用的同时,同样会作用到耳蜗内的相关功能细胞而产生大量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),造成线粒体的功能紊乱,引发细胞的凋亡或程序性细胞死亡,其结果是毛细胞或者螺旋神经节细胞的丢失,从而造成一定程度的听力损失,但是庆大霉素造成这些感受器细胞丢失的具体分子机制并不清楚。在研究活性氧的累积造成细胞凋亡的过程中发现,ROS能够通过mTOR(mammalian target of rapamycin)信号通路引发凋亡,但目前关于耳蜗内mTOR信号通路的研究非常有限。mTOR是哺乳动物体内雷帕霉素的靶蛋白,在哺乳动物的器官或组织中大量表达,能够调节细胞增殖、分化、代谢、凋亡等,然而目前尚不清楚mTOR信号通路是否参与庆大霉素造成的耳毒性。我们通过在体腹腔注射、耳蜗急性给药、离体培养螺旋神经节组织等方式在C57小鼠上建立庆大霉素所致的耳毒性模型,探究庆大霉素耳毒性的分子机制及保护措施。我们通过电生理的方法记录了庆大霉素和呋塞米联合给药前和给药15天后的小鼠听性脑干电位(auditory brainstem response,ABR)和耳蜗内电位(endocochlear potential,EP);分别通过鬼笔环肽(phalloidin)染色和尼式(nissl)染色观察庆大霉素造成的听力损失前后毛细胞和螺旋神经节细胞数目及形态的变化,通过HE染色观察耳蜗内血管纹和螺旋韧带的变化;通过免疫荧光染色和免疫印迹法(WB)的方法探究对照组和在体造模成功组凋亡因子caspase 3表达量的变化及其与听力损伤程度的关系;分别在庆大霉素在体给药和耳蜗急性给药的条件下,通过免疫染色和免疫印迹法探究耳蜗内mTOR通路中的关键因子表达水平的变化;离体培养螺旋神经节组织后通过免疫染色的方式观察生长出来的神经纤维变化,并对纤维密度和长度进行统计,探究雷帕霉素是否能够保护庆大霉素造成的螺旋神经节细胞的损伤。实验结果发现,通过在体联合给药方式造成的听力损失小鼠的螺旋神经节细胞有一定程度的丢失,并观察到了细胞凋亡因子的表达量明显上升且与听力损失程度正相关;离体培养螺旋神经节组织后,庆大霉素同样能损伤螺旋神经节细胞,降低神经纤维的密度和长度。庆大霉素在体给药和耳蜗内急性给药的条件下的耳蜗内mTOR通路中的关键因子p70S6K和4EBP1的磷酸化水平显著增高。并且mTOR通路中的关键激酶AKT、S6K和4EBP1的磷酸化水平与耳蜗内给庆大霉素呈现一定的剂量相关性。在培养时加入mTOR信号通路的特异性抑制剂雷帕霉素后,观察到与庆大霉素组相比,雷帕霉素预处理组的螺旋神经节细胞的损伤程度明显减低,神经纤维的密度和长度明显增高。我们的研究结果表明mTOR通道参与了庆大霉素引起的螺旋神经节细胞的凋亡,离体条件下雷帕霉素在庆大霉素造成的螺旋神经节细胞损伤中具有一定保护作用。
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