论文部分内容阅读
伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染动物机体后所引起的一种烈性急性传染病,通常引起机体发生呼吸困难、神经症状和奇痒（除猪以外）等症状,致死率极高,给养殖产业带来巨大的危害的同时也对人类公共卫生安全产生威胁。自2011年以来,我国相继爆发新一轮的猪PR疫情,病毒变异速度极快,原有的经典疫苗Bartha-K61已不能提供有效保护力,且目前还未研发出特效药物防治该病,仍旧以疫苗免疫为主要的预防手段。三肽囊素（Bursin,BS）是结构为赖氨酸-组氨酸-甘氨酸（Lys-His-Gly-NH2）的活性小分子肽,提取于禽类法氏囊。大量研究表明BS具有促进机体生长发育和增强机体免疫水平的功能。本课题组研制的原核表达融合BS为串联表达的BS四肽与血清白蛋白结合肽的融合蛋白,为天然BS的类似物,本课题组前期研究表明该物质可以显著提高免疫抑制动物的生产性能和免疫性能,值得注意的是,该融合BS具有显著的抗病毒作用,这在已有的BS相关文献中鲜有报道。因此,本研究以PK-15细胞和小鼠为模型,探究融合BS在体内和体外对PRV复制水平及其致病作用的影响,从而为发掘融合BS的抗病毒效用以及临床防控PR提供新思路。一、融合BS在PK-15细胞上对PRV的抑制作用研究1.TCID50的测定在本研究中,以PRV-MQ18病毒原液盲传6代后纯化进行TCID50测定,结果显示PRV-MQ18的病毒滴度为10-8.52/0.1m L。2.融合BS最适安全孵育浓度测定为确定融合BS对体外培养的PK-15细胞的作用最适浓度,设置0μg/m L、1μg/m L、5μg/m L、10μg/m L、50μg/m L等5个浓度梯度分别处理细胞24h、48h、72h后收样,以CCK8试剂盒进行细胞活性检测,结果表明5μg/m L的融合BS对PK-15细胞毒性较小,且48h最佳。3.融合BS对PRV感染细胞作用的最适浓度摸索在体外培养的PK-15细胞培养液中接种3.3×10~4TCID50的PRV,并加入终浓度为1μg/m L、5μg/m L、10μg/m L的融合BS作用48h,收集样品进行q-PCR,检测病毒g E基因表达量水平,结果表明:当融合BS浓度为5μg/m L时,病毒基因表达量下降31%（P＜0.001）,1μg/m L浓度时,病毒基因表达量下降27%（P＜0.001）,而当10μg/m L浓度时仅下降15%（P＜0.05）,因此5μg/m L的融合BS为最适浓度。4.最适浓度融合BS作用下的PRV感染滴度的摸索以3.3×10~6TCID50、3.3×10~5TCID50、3.3×10~4TCID50、3.3×10~3TCID50的浓度接种细胞,并加入终浓度5μg/m L的融合BS作用48h,收样进行q-PCR检测,结果显示病毒滴度在3.3×10~5TCID50下抑制病毒基因表达率为23%（P＜0.01）,而在病毒滴度为3.3×10~4TCID50下抑制病毒基因表达率为33%（P＜0.01）。5.融合BS作用时间优化将病毒滴度为3.3×10~4TCID50的PRV-MQ18接种于PK-15细胞中,并且加入终浓度为5μg/m L的融合BS作用各24h、48h、72h后收集样品q-PCR检测,结果表明:24h时融合BS组g E基因表达量下降19%（P＜0.05）;48h时,融合BS组的g E基因表达量下降27%（P＜0.001）;72h时,病毒感染导致细胞大量死亡,各组g E基因表达量差异不显著（P＞0.05）。因此终浓度为5μg/m L的融合BS作用于细胞,且在3.3×10~4TCID50的病毒滴度下感染48h可获得最佳的抗病毒感染效果。6.三种给药模式下融合BS对PRV的抗病毒作用设计融合BS的3种给药模式,分别是A组:在细胞攻毒前6h以5μg/m L的融合BS孵育,待PRV孵育完成后继续置于含5μg/m L的融合BS培养液中培养48h;B组:在PRV孵育的同时加入含5μg/m L的融合BS溶液,之后置于5μg/m L的融合BS培养液中继续培养48h;C组:在PRV孵育完成后常规培养6h,再更换成含5μg/m L的融合BS培养液继续培养48h;另设空白对照组和攻毒对照组,同一时间进行病毒的孵育以及培养液的更换,继续培养48h;结果表明,与感染组对比,三种给药模式均可以有效的抑制g E基因的复制,以A组效果最佳,抑制率达到34%（P＜0.001）,而B组为25%（P＜0.01）,C组为20%（P＜0.05）。以上结果表明,融合BS在5μg/m L的浓度下与病毒滴度在3.3×10~4TCID50情况下作用于PK-15细胞48h后能够体现良好的抑制病毒基因的复制效果的能力,因此,融合BS或许能够成为一种抗PRV感染的抑制剂。二、融合BS在小鼠体内的抗病毒作用研究1.实验动物的分组及处理将SPF级6-8周龄雌性BALB/c小鼠适应喂养后分为5组:A组于第7d、14d腿部肌肉注射可溶性融合BS纯化浓缩液;B组于第7d、14d腿部皮下注射Bartha-K61活疫苗;C组于第7d、14d时均同时注射融合BS+Bartha-K61活疫苗;攻毒对照D组与空白E组在实验组免疫同时注射DMEM培养液。2.LD50的测定将病毒原液稀释成9个浓度(10~0TCID50～10~8TCID50),以每个梯度的PRV以灌胃的方式各感染5只小鼠,饲喂7d后,根据公式计算得出LD50=10-1.48/0.1m L。3.小鼠死亡率与攻毒后存活率二免完成之后攻毒前,B组（疫苗组）小鼠死亡率达到75%,C组（融合BS+疫苗组）死亡率仅为55%,且观察发现C组小鼠出现神经症状的时间比B组延后8-10h。攻毒后小鼠生存率为A组30%,B组20%,C组33%,D组10%,对比发现,其他组的小鼠存活率均高于D组攻毒对照组,以上结果初步说明融合BS能够降低PRV感染后的致死率。4.CD4+/CD8+检测二免后第5W（攻毒后第7d）对每组小鼠的抗凝血以流式细胞术进行T细胞数检测,结果表明,攻毒对照组（D组）小鼠的血清CD4+/CD8+的比值明显低于空白组（E组）（P＜0.05）,A组与B组相差不大,而C组小鼠CD4+/CD8+比值显著高于A、B、D组（P＜0.05）,说明融合BS能够增强小鼠的免疫力,且与疫苗混合免疫效果更佳。5.血清g B抗体检测于第5W随机选取每组小鼠采血后用于血清g B抗体检测,结果发现,其他各组的小鼠血清g B抗体水平均高于D组;以B组和C组产生g B抗体效果最好（P＜0.001）,且C组抗体水平略高于B组,效果更佳;A组产生的g B抗体水平适中（P＜0.01）,D组无融合BS干扰产生g B抗体能力较差（P＜0.05）,说明融合BS能够对g B抗体生成起到促进作用。6.q-PCR检测小鼠各组织间的病毒复制水平第5W时采样进行q-PCR检测结果表明,A、B、C组小鼠的各组织中的病毒表达量均低于D组,其中D组与C组的各组织间的病毒表达量均具有最为显著的差异性（P＜0.001）;D组与A组中,以肝和肺组织中病毒载量差异显著（P＜0.01）,其余组织间差异明显（P＜0.05）;D组与B组中,以心、肝和肺组织中的病毒量差异极显著（P＜0.001）,其余组织间差异显著（P＜0.01）;以上结果说明,融合BS在小鼠体内各组织中也能发挥积极作用,抑制PRV的复制。7.HE实验病理切片观察发现,A、B、C、E组与D组（攻毒对照组）对比发现症状明显减轻,其中C组的组织病变程度明显低于A组和B组,仅仅略严重于E组（空白组）。而在各组织中,心组织中以C组免疫效果最好,有效降低心肌纤维断裂程度;肝组织中,D组小鼠肝细胞大量肿胀变大及发生空泡变性,肝窦间隙消失,以C组免疫方法干扰后,病变明显减少;脾组织中D组充血明显,红白髓区域界线模糊,免疫后以C组效果最佳,症状最轻;肺组织中D组大量肺泡高度扩张,肺泡壁变厚,肺泡内可见出血,免疫后肺脏病变明显减少,各组中C组免疫效果最好;肾组织中肾小球囊壁增厚,肾小管坏死,免疫后有效缓解症状,其中以C组免疫方式最佳;脑组织中,D组小鼠脑神经细胞广泛发生变性肿大,大量崩解坏死,免疫后发现神经细胞病变大幅减少,同样以C组免疫效果最好。以上结果说明融合BS能够在小鼠体内起到良好作用,减缓机体感染病毒的症状表现。三、结论本研究表明:融合BS在动物体内外均可显著降低PRV滴度,体内实验表明融合BS可降低PRV对小鼠的致病力,有望成为一种新型的抗PRV药物,对防控PR具有重要的理论和实践价值。