布鲁菌属、类鼻疽伯克霍尔德菌分别可导致布鲁菌病、类鼻疽两种人畜共患传染病,这两种疾病都具有传播性强和致病率高的特点,对人类的生命安全危害极大,其中布鲁菌病在我国被归类为乙类传染病,美国CDC将其定义为“B类生物恐怖主义药剂”;霍乱弧菌可引起一种病死率较高的人类易感烈性肠道传染病,属甲类传染病;金黄色葡萄球菌则是一种常见的引发院内和社区感染的食源性致病菌,因感染而引发食物中毒事件的报道屡见不鲜。快速的对引起公共卫生事件的病原体进行准确检测,是防止疫情扩散,降低国家、社会及人民损失的有效手段。本研究利用重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification,RPA）方法,CRISPR/Cas12a作为生物传感器结合荧光信号接收器,设计出针对病原细菌的实时荧光RPA检测平台和RPA-CRISPR/Cas12a检测平台,并建立以上4种病原细菌的实时荧光RPA检测技术,以及布鲁菌属和类鼻疽伯克霍尔德菌的RPA-CRISPR/Cas12a检测技术。使用布鲁菌属保守毒力基因序列（omp2a）,类鼻疽伯克霍尔德菌染色体上的特异保守序列（LC2）,霍乱弧菌的特异保守序列（ompW）和金黄色葡萄球菌辅助耐药基因（fem B）为靶标,设计RPA扩增引物和RPA荧光探针,分别建立了4种病原细菌的实时荧光RPA检测技术。在4种病原细菌的实时荧光RPA检测技术的灵敏度评价中,以含有4种特异靶标序列的重组阳性质粒为模板DNA,其理论检测灵敏度均达20 copies/反应,而霍乱弧菌和金黄色葡萄球菌检测灵敏度可达2 copies/反应;以4种病原细菌基因组DNA为模板DNA,最低可检测出50 fg/反应羊布鲁菌基因组DNA、100 fg/反应类鼻疽伯克霍尔德菌基因组DNA、5.46 fg/反应霍乱弧菌基因组DNA和3.72 fg/反应金黄色葡萄球菌基因组DNA,所有检测均在10 min内完成。在以靶标菌基因组DNA和其他多种非靶标菌混合基因组DNA为模板DNA的特异性评价中,4种病原细菌的实时荧光RPA检测技术均具有良好的特异性。针对同一靶标的RPA扩增序列设计crRNA建立布鲁菌属和类鼻疽伯克霍尔德菌的RPA-CRISPR/Cas12a检测技术,并评价灵敏度和特异性。通过设置阳性质粒和基因组DNA浓度梯度作为模板DNA,确定了2种检测技术的质粒灵敏度均达到2 copies/反应,布鲁菌属RPA-CRISPR/Cas12a检测技术能检出5 fg/反应的羊布鲁菌基因组DNA,类鼻疽伯克霍尔德菌RPA-CRISPR/Cas12a检测技术能检出20fg/反应的类鼻疽伯克霍尔德菌基因组DNA,且所需检测时间为40min;以多种非靶标菌混合基因组DNA作为模板DNA,评价了2种病原菌检测技术均只对各自靶标菌基因组DNA有阳性信号,具有良好的特异性。为评价RPA-CRISPR/Cas12a检测平台的实际应用价值,本研究为布鲁菌制备模拟临床样本（人全血）和模拟食品样本（牛奶）,类鼻疽伯克霍尔德菌制备了模拟临床样本（人全血）和模拟环境样本（土壤）,并以模拟样本提取基因组DNA作为模板DNA,分别使用布鲁菌属和类鼻疽菌RPA-CRISPR/Cas12a检测技术和已有文献报道的RT-PCR方法进行对比检测。检测结果表明2种病原检测技术有优于RT-PCR方法的灵敏度,并且与人全血、鲜牛奶、土壤基因组DNA均无交叉反应。此外,在2021年（UNSGM）生物武器核查指定实验室间的布鲁菌国际测试中,RPA-CRISPR/Cas12a检测结果与实时定量-PCR和高通量测序的结果完全一致,且从接收样本、提取核酸、得到准确的检测结果仅需90 min,显示出现场使用的优势。综上,本研究建立了布鲁菌属、类鼻疽伯克霍尔德菌、霍乱弧菌和金黄色葡萄球菌等4种病原细菌的实时荧光RPA检测技术;建立了布鲁菌属和类鼻疽伯克霍尔德菌的RPA-CRISPR/Cas12a超灵敏检测技术。上述两种检测平台均具有反应快速、便携、灵敏度高、特异性好的优点。并且在布鲁菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的模拟样本检测评价中表现出特异、灵敏的检测能力,具有较好的实际应用价值。此外,由于RPA和CRISPR温和的反应条件,可在配有锂电池的恒温核酸快速扩增检测系统上完成反应及信号检测,该检测系统小巧轻便、能在野外持续工作12h,因此,本研究设计的检测平台能够应用于野外疫区现场、乡镇医院和基层诊所,实现对病原菌的快速检测,精准防控。该检测平台在早期临床诊断、疾病预防、环境分析和食品安全检测等领域具有十分广阔的应用前景。