枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide,LBP)来源于枸杞果实,作为一类具有生物活性的物质,具有抗肿瘤、改善肝损伤、改善亚健康状态、改善糖尿病等功效。目前LBP对2型糖尿病(Type 2 diabetes,T2D)改善作用研究在人群、动物和体外研究均得到证实,还具有改善胰岛素抵抗以及维持β细胞功能,但是研究机制结果并不统一,降糖作用和相关机制仍有待探究。代谢组学是在基因组学、蛋白质组学之后才发展的,目前在相关研究中已成为热点,主要研究机体受外界因素影响下,体内代谢产物的变化规律。人群营养相关的代谢组学已成为营养流行病学膳食标志物筛选的新方法,然而目前还未有植物多糖相关的人群代谢组学研究,更没有针对植物多糖干预T2D人群的代谢组学研究。为了研究LBP降血糖的机制,需进一步探索LBP对人群的代谢组学影响,探究LBP可能降糖机理。本文在课题组前期研究的基础上,对枸杞相关近20年的研究方向进行了探讨,阐明了 LBP和糖尿病相关研究是枸杞研究中的热点;探讨LBP对健康人群的糖脂代谢影响的血清、尿液代谢组学干预研究;鉴定与T2D人群、T2D人群合并肥胖或高脂血症的代谢产物差异,探究T2D发生发展过程中的代谢物变化;研究LBP干预对T2D人群血清代谢产物影响的研究;利用胰岛素抵抗模型的HepG2细胞观察不同剂量的LBP对肝癌细胞的氨基酸代谢酶以及糖原合成酶的作用研究。本文通过研究LBP对不同人群的干预作用,为LBP的研究提供新思路,为深入研究LBP等多糖类物质提供科学依据。主要研究工作如下:1.枸杞研究的文献计量学分析:从2000至2018年以Web of Science核心合集引文数据库(仅选择SCI-EXPANDED)为检索对象,并提取发表于2000年1月1日至2018年12月30日的文献,并于2019年3月1日完成检索。使用Web of Science数据库的分析检索结果和引文报告功能,并将数据导出至Microsoft Excel、CiteSpace、Vosviewer软件,进行描述性分析和定量分析。共计检索到976篇枸杞相关文献,合计被引频次16646。多个国家参与以及进行过枸杞相关研究,其中中国是研究枸杞最热的国家,这可能与枸杞产自中国有关。中国科学院是发表枸杞相关文献最多的机构。另外Carbohydrate Polymers是参与发表枸杞相关文献最多的杂志,共收到1340次被引频次。枸杞相关文献主要包括结构和成分鉴定、枸杞多糖相关研究以及枸杞功能研究等研究方向。枸杞多糖和糖尿病方向的研究是研究者主要关注的方向,但是目前仍缺乏系统的机理研究。2.枸杞多糖对健康中青年人群的代谢组学干预研究LBP提取于枸杞,是具有生物活性的生物大分子化合物。营养干预可以影响体内代谢物谱,目前可以通过代谢组学技术实现以往的技术短板。然而关于多糖物质在体内如何影响代谢物还未知。LBP能否影响成年人的健康仍不清楚,LBP能否以及如何影响体内的代谢物也未知,因此,我们研究了 LBP对健康男性人群的血清和尿液代谢组学的影响。研究共纳入42例健康男性志愿者,分为干预组和对照组,给予干预组300mg的LBP持续28天,并在干预前后进行人口学以及血液学指标的检测,利用GC-TOF-MS检测代谢产物并利用SIMCA软件进行数据分析统计。作为首次研究LBP对健康成人干预影响,也是第一篇LBP对健康成人代谢组学影响的研究,我们发现每天摄入300mg的LBP可以显著降低TG/HDL指数,降低血清D-塔格糖水平、增加血清磷酸盐和亮氨酸水平,加速消除尿液中4-羟基甘露腈1,减少尿液中酪氨酸1,3-氨基异丁酸1、苏糖醇和核糖水平。代谢通路分析结果显示,LBP补充调节甘油磷脂代谢、酪氨酸代谢,提示LBP可能在三羧酸循环、脂肪酸代谢中起重要作用。3.2型糖尿病及合并高血脂或肥胖人群的代谢组学研究肥胖和血脂异常是胰岛素抵抗和T2D发展的危险因素。代谢组指在生物体中发现或产生的小分子代谢物,包括最小的生物标志物,可用于帮助研究因环境和生物学变化导致的糖尿病的可能机制、诊断以及个性化用药。本文调查了 T2D合并肥胖或者高脂血症人群的脂肪因子和炎症因子水平,旨在鉴定健康人群与T2D人群、T2D人群合并肥胖或高脂血症的代谢产物差异,以期探究T2D发生发展过程中的代谢物变化。本文共纳入研究人群78人,其中T2D组20人,T2D人群合并肥胖12人,T2D人群合并高脂血症26人,健康人群20人。记录参与者的体格检测指标,并收集血液样本,检测血常规、肝功能、肾功能、血糖、血脂、血清胰岛素、代谢产物的水平等,利用GC-TOF-MS检测代谢产物并利用SIMCA软件进行数据分析统计。研究发现,在糖尿病人群以及脂质功能失调人群存在一些共同的代谢差异物,与健康人群相比较,T2D人群血清乳糖和肉豆蔻酸水平下降,木糖2,3-羟基丙酸1、N-乙基甘氨酸1和法尼醇2水平增加。另外,T2D合并肥胖或者高血脂的人群中,相较于单纯的T2D,血清尿素和3-羟基丙酸1水平降低,双-(2-羟丙基)-胺2水平升高,提示我们T2D与T2D合并肥胖或高血脂之间代谢亦不相同。另外,本文还比较了肥胖与高血脂人群之间的代谢差异,结果发现,与单纯T2D患者相比,T2D合并肥胖患者中血清苯乙酸和2-棕榈酸水平降低,天冬氨酸1、D-甘油酸、酪氨酸1、苏糖醇、谷氨酸和白皮杉醇2水平升高,而T2D合并高血脂患者中血清甘氨酸2、半胱氨酸、2-羟基吡啶、丙酮酸、3-羟基丙酮酸、丙醇二酸和N-乙基马来酰胺酸3水平降低,2-酮-异戊酸1、葡萄糖-6-磷酸2、2’-脱氧腺苷5’磷酸盐水平升高。随后,代谢通路分析发现氨基酸代谢失调是影响T2D的因素,主要包括乙醛酸和二羧酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、牛磺酸和牛磺酸代谢、β-丙氨酸代谢、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢、和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢。T2D合并脂质代谢失调更进一步加快T2D进展,主要涉及到改变β-丙氨酸代谢、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸、精氨酸和脯氨酸、丙酮酸代谢。综上所述,T2D人群中氨基酸代谢失调,且伴随肥胖以及高血脂的T2D人群在T2D发展中其氨基酸代谢进一步失调。4.枸杞多糖对2型糖尿病人的代谢组学干预研究本课题组利用LBP对T2D人群进行干预研究,为了尽可能降低人群之间的差异性,本文观察同一人群干预3个月前后的代谢组学变化。选取20例单纯T2D人群,给予300mg的LBP干预3个月,比较干预前后人群的代谢产物的变化,利用GC-TOF-MS检测代谢产物并利用SIMCA软件进行数据分析统计。本文是首次研究LBP对T2D人群的代谢组学影响,本文研究发现每天摄入300mg的LBP可以降低T2D人群的空腹血糖水平(△空腹血糖=0.64mmol/L,P=0.057),还可以显著升高血清胰岛素样生长因子的血清水平结合蛋白(insulin-like growth factor bindingprotein,IGFBP)水平,降低T2D人群血清样本中磷酸盐、胱氨酸、花生四烯酸、尿素、丙酮酸、果糖2,6-二磷酸盐降解产物2、2-脱氧四酸、3-羟基丙酸1、葡萄糖庚酸1、4-氨基丁酸3、5,7-二羟基-3-(4-甲氧基苯基)苯并吡喃-4-酮、N-乙基马来酰胺酸3和N,N-二甲基精氨酸水平以及升高D-甘油酸、木糖2、2-酮-异戊酸1、琥珀酸半醛2、乙酰醇4、双(2-羟丙基)胺2、白皮杉醇2、β-谷氨酸1、3,5-二羟基苯甘氨酸1、N-(2-羟乙基)-亚氨基二乙酸1和法呢醛的水平。随后代谢通路分析发现,LBP干预后主要涉及维生素B6代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、戊糖磷酸途径,丁酸酯代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、丙酮酸代谢、花生四烯酸代谢、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢、糖酵解或糖原生成等代谢途径调节。5.枸杞多糖对胰岛素抵抗模型HepG2细胞的影响如前所述,我们研究了 LBP对T2D的干预实验,并利用代谢组学探究可能的降糖机理,发现LBP可以调节T2D病人的D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢。肝脏通过调节糖代谢,维持葡萄糖利用和储存。探讨LBP对人肝癌HepG2细胞的干预作用,研究不同剂量的LBP作用下HepG2细胞的增殖作用,探究在胰岛素抵抗下,不同剂量LBP对HepG2细胞的糖原合成酶(glycogen synthase,GS)、肝脏谷氨酰胺酶(hepaticglutaminase2,GLS2)蛋白的影响。利用1×10-7mol/L胰岛素建立胰岛素抵抗HepG2细胞,设立不同浓度的LBP(300ug/ml、75ug/ml、18.75 ug/ml)组、模型对照组、正常对照组,干预24小时后,收集细胞,进行指标测定。结果显示采用不同剂量的LBP对人肝癌HepG2细胞干预后,LBP促进HepG2细胞的增殖。不同剂量的LBP促进GS蛋白的表达,并表现出剂量效应关系。LBP能够抑制GLS2蛋白的表达,但是无剂量效应关系。根据研究结果,可知LBP通过抑制GLS2蛋白表达,促进谷氨酰胺代谢,又促进GS的蛋白表达,进一步影响糖原合成,最终调节血糖水平。结论:1.文献计量学研究显示2000-2018年枸杞相关发表文献呈现持续增长的趋势。世界范围内枸杞相关发表文献主要研究领域包括化学、生物化学、分子生物学和农业研究,未来亟需更多分子生物以及生物功能探索研究,枸杞多糖与糖尿病相关疾病的研究目前成为研究热点。2.300mg/d的LBP干预健康男性人群4周能够有效地调节血清TG/HDL指数,且可能与LBP对人群血清和尿液中的代谢物具有调节作用,影响甘油磷脂代谢和酪氨酸代谢。3.探究了糖尿病人群以及脂质功能失调人群中的血清代谢组学变化。肥胖可能加重某些代谢物的失调,主要包括β-丙氨酸、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢。高脂血症可以促进T2D的发展,并且主要包括改变甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢、丙酮酸代谢。综上所述,氨基酸代谢在T2D的发生中发挥积极作用,并且肥胖以及高血脂在T2D发展中其氨基酸代谢进一步失调。4.研究发现摄入300mg/d的LBP可以降低T2D人群的空腹血糖水平,这可能与升高血清IGFBP水平,与调节维生素B6代谢、氨基酸代谢和糖酵解或糖原生成有关。5.利用胰岛素抵抗模型人肝癌HepG2细胞,观察不同浓度的LBP对GLS2、GS蛋白表达的影响,结果发现LBP可以抑制GLS2蛋白表达,促进GS蛋白表达,通过影响糖原合成,起到降血糖作用。