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溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)属炎症性肠病(inflammatorybowel disease,IBD),呈慢性、反复发作性。近年来,UC发病率呈逐渐增长的趋势,目前对UC的治疗尚无特异、有效且无毒副作用的药物,因此,迫切需要探索新的、有效的治疗手段。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有高度自我更新能力,可向三个胚层的细胞分化,在干细胞移植治疗和组织工程等领域有广阔的应用前景。目前已有MSCs治疗IBD的报道,但其在肠道的分化及治疗机制仍不十分明确。本实验拟分离、培养、扩增大鼠骨髓MSCs,DAPI标记后经静脉移植入UC模型大鼠,观察MSCs对UC的治疗效果,并探讨其可能的机制。
第一部分、大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定
1材料与方法
1.1 取3-4周SD大鼠的股骨、胫骨骨髓,贴壁法分离、培养、扩增MSCs。镜下观察原代细胞和传代细胞的形态和生长情况。流式细胞仪检测第3代MSCs(P3-MSCs)表达CD29、CD90和CD45的情况。
1.2 取P3-MSCs,分别进行成骨诱导和成脂诱导。
2.结果：
2.1 MSCs原代培养后3～12h后即见部分细胞贴壁生长。培养3～12d,细胞数量迅速增多,多呈梭形及漩涡状排列。传代后MSCs生长快于原代细胞。P3-MSCs生长滞留期约为24～48h,对数增殖期约为3～6d,7～8d后进入平台期,6代后细胞出现衰老征象。流式细胞仪检测结果显示:P3-MSCs表面标记物CD29、CD90阳性,CD45阴性。CD29、CD90均一性分别为99.82±0.11％、99.84±0.25%。
2.2 MSCs经成骨诱导后,细胞变为多角形或不规则形,Von Kossa染色后有钙化结节形成;对照组仍为长梭形,未见钙化结节形成。MSCs经成脂诱导后,细胞变为圆形或椭圆形,胞质充满脂滴,油红O染色脂滴呈橘红色;对照组细胞仍为长梭形,无脂滴出现。
第二部分、骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠溃疡性结肠炎
1 材料与方法
1.1 DAPI标记P3-MSCs备用。
1.2 SD大鼠45只随机分为移植组、PBS组和正常对照组。移植组和PBS组用免疫复合法制备UC模型。建模后24h,三组大鼠均经尾静脉注射1mL液体:移植组为DAPI标记的P3-MSCs(3×106)悬液,PBS组及正常对照组为PBS。
1.3 每天观察动物的症状和体征。移植后3d、7d、14d,3组各处死5只,解剖观察结肠病变,并制备HE染色石蜡切片,光镜下观察结肠组织病理变化。
1.4 各时间点取移植组结肠组织,制备冰冻组织切片。荧光显微镜下观察移植的MSCs在结肠的分布,每组切片在随机10个高倍(×200)视野下计数DAPI标记的细胞数目:免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜下观察移植的MSCs细胞角蛋白(cytokeratin,CK)的表达。
2.结果：
2.1 DAPI标记后的MSCs细胞核发明亮蓝色荧光,标记后14d仍有约90%的细胞可观察到荧光。
2.2 移植MSCs后,移植组大鼠症状明显改善。结肠组织石蜡切片显示移植后7d、14d移植组结肠病变的修复均明显优于。PBS组。
2.3 各时间点移植组均见DAPI标记的MSCs,主要分布于黏膜层和黏膜下层,肌层和外膜层偶见,且溃疡周边黏膜层的分布略多于正常部位。统计结果显示,移植细胞数随时间增多,至14d时最多(P＜0.05)。移植后7d、14d,移植组结肠组织可见少量DAPI标记细胞表达CK。
全文结论：
1.用贴壁筛选法,成功分离、培养和扩增大鼠骨髓MSCs。流式细胞仪检测显示培养的P3-MSCs具有MSCs的表型特征。
2.P3-MSCs在体外可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,证明所分离的MSCs具有多向分化的能力。
3.经尾静脉移植骨髓MSCs对大鼠溃疡性结肠炎有明显的治疗作用。
4.移植后第3,7,14天,均可见标记MSCs分布于大鼠结肠,且在溃疡部位的分布多于正常部位,提示病损组织和器官对MSCs可能有特异性趋化作用。
5.少量移植细胞表达CK,说明MSCs可能分化为肠上皮细胞,直接参与受损结肠上皮的修复。