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细菌耐药性是目前全球最紧迫的公共卫生问题之一。在缺乏新的抗菌药物的情况下,替加环素和多粘菌素成为治疗多重耐药革兰氏阴性菌,特别是耐碳青霉烯肠杆菌感染的“最后一道防线”。然而,质粒介导可水平转移的多粘菌素耐药基因mcr-1以及替加环素高水平耐药基因tet（X4）在全球范围内的流行,严重制约着多粘菌素和替加环素在治疗耐碳青霉烯肠杆菌感染中应用。目前的抗菌药物敏感性检测方法主要基于细菌生长,这些检测方法耗时长,并且将表型和基因型的检测分隔开;广谱治疗剂量抗生素虽然可以有效治疗敏感菌感染,但抗生素对肠道中的益生菌同样也会有影响,可能造成抗生素相关性腹泻等疾病。因此建立快速准确的mcr和tet（X）阳性菌株的检测方法,以及建立靶向安全有效的多粘菌素耐药菌的清除策略对于两种重要耐药菌的防控具有重要的科学意义。本论文根据tet（X）和mcr阳性大肠杆菌和阴性对照大肠杆菌在折点浓度抗生素处理后特定mRNA生物标志物表达量变化的不同,分别建立了基于特定mRNA标志物快速、准确的tet（X）和mcr阳性大肠杆菌检测方法;同时根据mcr-1耐药蛋白表达后,激活特定基因转录的特征,构建一种可以靶向清除mcr-1阳性多粘菌素耐药大肠杆菌的杀菌方法。具体结果如下:1.基于mRNA标志物tet（X）阳性大肠杆菌的快速检测在本实验中,我们构建了tet（X4）介导的替加环素耐药大肠杆菌DH5α+pUC19-tet（X4）,以及与其具有相似遗传背景的阴性对照大肠杆菌DH5α+pUC19。将DH5α+pUC19-tet（X4）和DH5α+pUC19用2 μg/mL替加环素处理60 min后,分为处理组和对照组进行转录组测序。在对转录组结果用韦恩图和PCA分析后我们发现,在替加环素处理后,DH5α+pUC19-tet（X4）和DH5α+pUC19转录组的变化截然不同。基于此,我们将在替加环素处理后,DH5α-pUC19中mRNA表达量发生显著变化,同时在DH5α+pUC19-tet（X4）中mRNA表达量不变的基因,在三株替加环素敏感大肠杆菌以及三株临床分离且背景清晰的tet（X4）介导的替加环素耐药大肠杆菌中进行验证,共有25个mRNA标志物符合筛选要求。我们对这25个mRNA标志物对替加环素不同处理时间和浓度的敏感性进行进一步验证,当替加环素处理10 min、处理浓度超过0.25μg/mL后,所选25个相关mRNA标志物的表达量在tet（X4）阴性菌中出现了不同程度的变化,但在tet（X4）阳性菌中并没有出现变化。对tet（X）其他变体阳性替加环素耐药大肠杆菌对的检测结果表明,此方法同样可以用于tet（X）变体介导的替加环素耐药大肠杆菌的检测。在准确性实验中,我们选取了 33株大肠杆菌临床分离株,用此方法进行替加环素敏感性鉴定,并用微量肉汤稀释法和PCR结果进行确证。结果显示,基于特定mRNA标志物的tet（X）阳性耐药大肠杆菌检测方法对33株临床分离大肠杆菌对替加环素敏感性的验证结果准确率为90.1%。以上结果表明,基于特定mRNA标志物的耐药菌检测方法在临床中可以有效检测tet（X）介导的替加环素耐药大肠杆菌。2.MCR介导的多粘菌素耐药大肠杆菌的快速检测在本实验中,我们构建了mcr-1介导的多粘菌素耐药大肠杆菌DH5α+pUC19-mcr-1,以及其阴性对照大肠杆菌DH5α+pUC19。分别将多粘菌素耐药菌和敏感菌用2 μg/mL多粘菌素处理60 min后,进行转录组测序。我们将在多粘菌素处理后,DH5α-pUC19中mRNA表达量发生显著变化（Log2FC≥2 or≤-2,p＜0.05）,同时在 DH5α+pUC19-mcr-1 中 mRNA表达量不变（-2≤Log2FC≤2）的基因,在三株多粘菌素敏感大肠杆菌以及三株临床分离且背景清晰的mcr-1介导的多粘菌素耐药大肠杆菌中进行进一步筛选,对18个符合筛选要求的基因对多粘菌素处理时间和刺激浓度进行了验证,当多粘菌素处理30 min、刺激浓度超过0.25 μg/mL后,所选18个相关mRNA标志物的表达量在mcr-1阴性多粘菌素敏感菌中出现了不同程度的变化,并且可以一直维持至刺激120min后,但这些基因的mRNA表达量在mcr-1阳性多粘菌素耐药菌中并没有出现变化。在对mcr-1变体介导的多粘菌素耐药大肠杆菌的检测结果中表明,此方法同样可以检测mcr-1其他不同变体介导的多粘菌素耐药大肠杆菌。在准确性实验中,我们选取了 30株大肠杆菌临床分离株,用此方法进行多粘素敏感性鉴定。结果显示,与微量肉汤稀释法和PCR的结果相比,基于特定mRNA标志物的mcr-1阳性耐药大肠杆菌检测方法正确区分了 28株临床分离大肠杆菌对多粘菌素的敏感性,准确率为93.3%。以上结果表明,基于特定mRNA标志物的耐药菌检测方法可以用于MCR介导的多粘菌素耐药大肠杆菌的快速检测。3.基于特异性表达mRNA的mcr-1阳性肠杆菌靶向清除方法的建立我们根据MCR-1耐药蛋白表达后引起细菌中特定基因转录水平升高的特征,设计构建了基于可转移质粒的mcr-1阳性菌靶向清除系统。首先我们构建了基于pBAD43的可接合质粒pBAD43-Kan-TraJ,然后将被点形念珠藻的断裂蛋白内含子DnaE片段分隔开的CcdB（ccdB-Int）作为杀菌蛋白。在阿拉伯糖启动子调控下的杀菌质粒pCcdB-Int中的毒力蛋白CcdB在阿拉伯糖诱导下,对大肠杆菌、沙门氏菌以及肺炎克雷伯菌的靶向清除效果良好,且mcr-1的存在与否并不会影响pCcdB-Int的接合转移频率以及靶向杀菌效率。我们将DH5α+pUC19-mcr-1和DH5α+pUC19的转录组结果进行比较,将mcr-1表达后,mRNA表达量显著升高（Log2FC≥2,p≤0.05）的基因作为候选基因,将候选基因上游2,000 bp部分序列作为候选基因启动子部分,将候选启动子克隆至ccdB-Int上游,构建在mcr-1阳性肠杆菌靶向清除候选启动子控制表达的可接合质粒系统;同时构建可以用作受体菌进行接合转移实验的mcr-1阳性大肠杆菌EC600+pUC19-mcr-1和阴性对照菌EC600+pUC19,利用接合的方式将mcr-1阳性肠杆菌靶向清除候选质粒转移至EC600+pUC19-mcr-1和对照菌EC600+pUC19中,并计算EC600+pUC19-mcr-1接合子与EC600+pUC19接合子的比值,将比值小于0.70的启动子作为候选基因阳性启动子。在筛选结果中有31个候选基因阳性启动子符合要求,我们选取了其中靶向清除mcr-1阳性大肠杆菌效果最好的四个候选基因启动子进行进一步验证。结果表明其对mcr-1阳性肺炎克雷伯菌有同样的清除效果,对mcr-1阳性沙门氏菌的清除效果稍差。且杀菌效率随着条件的不同也有所不同,当接合时环境温度升高,靶向清除mcr-1阳性菌的效率相应的升高,当温度升高至30℃时,清除效率达到最高;当接合环境pH值介于6-8之间时,靶向清除效率可以维持在最大值。以上结果表明,我们成功建立了一种可以特异性靶向mcr-1阳性大肠杆菌的清除策略。4.mcr-1阳性肠杆菌靶向基因对MCR功能的影响前文中我们筛选得到31个mcr-1阳性多粘菌素耐药大肠杆菌靶向清除候选基因启动子。为了探究这31个基因表达对MCR-1功能的影响,我们利用自杀质粒在大肠杆菌EC600中将这些基因进行无痕敲除,构建携带mcr-1的多黏菌素耐药EC600基因缺失株。我们测定了多粘菌素的敏感性、生长曲线、mcr-1转录水平的变化,以及基础条件下和不同浓度多粘菌素处理后外膜完整性、膜电势和活性氧含量的变化。对以上表型结果进行汇总分析后发现,EC600 ΔintD+pUC19-mcr-1 以及 EC600 ΔyafN+pUC19-mcr-1的 mcr-1 转录水平显著上升,但生长曲线与EC600+pUC19-mcr-1野生型对照没有差异。同时外膜完整性、膜电势变化以及活性氧含量变化的实验结果显示,在没有抗生素刺激的基础条件下,EC600ΔintD+pUC19-mcr-1以及EC600 ΔyafN+pUC19-mcr-1的外膜完整性下降,膜电势和活性氧含量的同样上升。在多粘菌素处理后,相同浓度处理组中的EC600ΔintD+pUC19-mcr-1以及EC600 ΔyafN+pUC1 9-mcr-1的外膜完整性、膜电势和活性氧含量的变化量均大于EC600+pUC19-mcr-1。以上结果表明,在mcr-1阳性肠杆菌中,intD和yafN基因可以通过负反馈调节对MCR的表达和功能产生影响,以适应不同的外界环境。5.intD和yafN/O的mcr-1阳性缺失株脂多糖对真核细胞毒性的作用本章实验中,我们对前文中提到的EC600 ΔintD+pUC19-mcr-1和EC600 ΔyafN+pUC19-mcr-1中提取脂多糖（LPS）,浓度均一化后用不同浓度LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7,我们对白介素1α、1β和6（IL-1α、IL-1β、IL-6）三种炎症因子的mRNA表达量以及上清中蛋白含量进行检测。荧光定量结果显示,与EC600+pUC19-mcr-1相比,EC600ΔintD+pUC19-mcr-1 和 EC600 ΔyafN+pUC19-mcr-1提取的 LPS 诱导产生 IL-1α、IL-1β、IL-6的mRNA表达量的最大值没有显著性变化,但半数有效浓度显著低于EC600+pUC19-mcr-1,诱导效率显著升高。在酶联免疫吸附剂测定（ELISA）上清中炎症因子的蛋白含量实验中,当刺激浓度为 10 ng/mL 时,EC600 ΔintD+pUC19-mcr-1 和 EC600 ΔyafN+pUC19-mcr-1的LPS刺激所分泌至培养液上清中IL-1α、IL-1β和IL-6的含量要显著多于EC600+pUC19-mcr-1。随后我们通过荧光定量、荧光探针DAF-FMDA以及Griess Reagent分别检测了 RAW264.7被刺激后一氧化氮合成酶的mRNA表达量、蛋白含量以及一氧化氮含量。结果显示,,与 EC600+pUC19-mcr-1 相比,EC600 ΔintD+pUC19-mcr-1 和 EC600ΔyafN+pUC19-mcr-1提取的LPS刺激细胞使一氧化氮合成酶mRNA表达量升高的半数有效浓度显著降低;相同浓度刺激细胞产生一氧化氮合成酶的含量升高。以上结果表明,EC600 ΔintD+pUC19-mcr-1和EC600 ΔyafN+pUC19-mcr-1中磷酸乙醇胺修饰量的增加,会导致提取出的LPS对小鼠巨噬细胞毒性的增大。综上,本研究建立了基于特定mRNA标志物tet（X）和mcr阳性大肠杆菌的快速检测方法,此方法可以快速检测由不同tet（X）和mcr变体介导的替加环素或多粘菌素耐药大肠杆菌;通过与传统MIC和PCR方法的检测结果进行比较,准确率均超过90%。同时我们基于MCR-1表达后引起的转录水平的变化,筛选出特定基因的启动子,成功建立了特异性靶向mcr-1阳性肠杆菌的清除策略,并对mcr-1靶向清除阳性启动子下游的基因进行了进一步的机制研究,确定了其与MCR表达和功能之间的关系。以上研究发现将为耐药病原菌的快速检测和靶向清除提供了全新的思路。