20世纪初,抗生素的问世被誉为医学史上的一个重大的里程碑,创造了许多医学奇迹,很多感染病得以治愈,然而大规模应用抗生素后其潜在的弊端越来越明显。人们开始慎重选择使用抗生素,医学界也不再把抗生素看成是“灵丹圣药”,迫使人们重新认识并评估抗菌药物。大多数容易获得的天然产物都被筛选出来,新抗生素的发现落后于细菌耐药性的发展。为了应对这一挑战,寻找广泛的抗菌药物来源,制定多维度的抗细菌感染策略迫在眉睫。来自植物的含硫化合物也被认为是有效的抗菌物质,大蒜素提取的活性成分,对多种细菌、真菌、病毒有杀灭和抑制作用,被称为“天然广谱植物杀菌素”。然而,大多数有机多硫化物是疏水的,水溶性低和生理条件下稳定性差,严重限制了其临床应用。除了有机多硫化物外,自然界中还存在大量的各种无机多硫化物矿物药,矿物药作为传统中医药文化的重要组成部分,两千多年来一直发挥着重要作用。矿物药资源分布广泛,具有独特的疗效,因此,矿物药物的开发、研究和应用具有广阔的前景。然而大多数矿物药不可避免地存在一定的肝毒性和肾毒性,以及重金属的积累,其安全性问题仍然是其开发的瓶颈。自然铜（Pyrite）主要化学成分为FeS2,经过炮制后成分转变为Fe7S8,自然铜作为传统中药,研究显示有显著抗菌抗真菌作用。利用现代制剂优化矿物药制剂提高疗效,克服中药溶解度差、生物利用度低、毒性强的缺点,对矿物药、植物中成药的开发利用十分必要。本课题组前期研究使用大蒜素提供硫源合成的具有类过氧化物酶活性的无机硫化铁纳米酶,具有广谱杀菌抗病毒作用。然而,研究发现,在富营养条件下,硫化铁纳米酶的抗菌活性很大程度上受到抑制,哪种细菌对硫化铁纳米酶敏感尚不清楚,此外矿物衍生的铁硫化物存在于不同的晶体相中,目前尚不清楚哪种类型的铁硫化物显示出最有效的抗菌性能。这是硫化铁纳米酶体外抗菌到生物体内抗菌应用过程需要解决的两个重要问题。我们选取不同形式的硫化铁,包括参考课题组前期研究方法,优化方案以DADS为硫源合成了纯相硫化铁D-Fe3S4,另外选取中药自然铜（z-Fe7S8采用中药热疗-醋淬法煎煮）,此外选取商品化不同形式硫化铁FeS2（黄铁矿）和FeS,通过对不同形式硫化铁材料进行抗菌筛选,并在富营养条件下研究了它们对G+、G-和G变异（G.vaginalis）等不同类型细菌的抗菌活性差异及其具体选择性抗菌机制。最后,对D-Fe3S4生物安全性进行了多方面的评估,根据D-Fe3S4选择性抵抗G.vaginalis的特点将其应用于BV的治疗。接下来将从以下几个部分进行具体研究:第一部分,硫化铁材料的制备和表征研究显示硫化铁纳米材料有着高效广谱的抗菌作用,为了寻找最佳的抗菌药物替代品,我们通过水热合成法合成了纯相的D-Fe3S4,并与天然矿物中成药自然铜z-Fe7S8、及s-FeS2和s-FeS等硫化铁材料进行对比分析。首先通过扫描电子显微镜及透射电子显微镜对不同形式硫化铁材料进行形貌表征,为了研究不同硫化物具体结构成分差异,我们采用XPS、红外光谱分析、EDS等方法对硫化铁成分进行辅助分析鉴定,使用XRD进行材料结构和成分分析。为研究具体何种成分在发挥抗菌作用,为硫化铁抗菌机制研究打下基础,使用铁含量检测试剂盒、多硫探针SSP4和质谱鉴定分析对硫化铁材料释放的亚铁和多硫化物进行定性定量分析。最后,通过对4种硫化铁进行了结构模型解析,分析其Fe-S键长键能,为硫化铁释放亚铁多硫化物能力差异提供了证据。第二部分,硫化铁材料选择性抗菌作用评估在本章中,通过对4种硫化铁材料D-Fe3S4、z-Fe7S8、s-FeS2和s-FeS,在富营养条件下进行抗菌活性作用规律筛选,选择了 3种类型细菌中的7种,G+中3种代表（S.aureus、Streptococcus和Lactobicillus）、G-中的 3 种代表（E.coli、P.aeruginosa和A.baumannii）及G变异性的G.vaginalis。4种材料抗菌活性从高到低的规律D-Fe3S4＞z-Fe7S8＞＞s-FeS2和s-FeS。结果显示亚稳态硫化铁包括纳米D-Fe3S4,z-Fe7S8在富营养条件下具有抗菌选择性,进一步选取抗菌效果最强的D-Fe3S4进行后续研究发现,D-Fe3S4抗菌选择性方面有革兰变异菌（G.vaginalis）＞革兰阴性菌（E.coli）＞＞革兰阳性菌（S.aureus）。此外,我们构建了 4种形式的G.vaginalis耐药菌（耐甲硝唑菌株、持留菌菌株、生物膜菌株和胞内菌菌株）,研究显示D-Fe3S4对不同形式的G.vaginalis耐药菌均有非常强的抑制效果,且不易产生新的耐药性。此外,研究显示自然铜对G.vaginalis浮游菌和生物膜均有显著性抑制作用。第三部分,D-Fe3S4革兰依赖选择性诱导G.vaginalis死亡机制研究本部分在前一章研究发现亚稳态硫化铁革兰依赖选择性抗菌的基础上,继续探究D-Fe3S4选择性抗菌机制。1.通过多种多硫化物和亚铁对不同细菌抑菌筛选发现富营养条件下主要是多硫化物起到选择抗菌作用。2.发现选择性抗菌机制和不同细菌细胞壁有关,多硫化物和亚铁都未能突破细菌壁的屏障进入E.coli和S.aureus内,而G.vaginalis内可见较强的多硫化物或亚铁信号。3.通过转录组学和代谢组学测试,分析了 D-Fe3S4和多硫化物处理对G.vaginalis的转录组和代谢组的影响并验证。4.通过研究显示,D-Fe3S4对G.vaginalis糖酵解途径有致死性的抑制作用,通过对糖酵解途径关键酶GLK进行蛋白结构预测,结果表明,G.vaginalis的GLK三维结构包含一个典型的口袋状活性中心,其边缘含有半胱氨酸残基,推测多硫化物通过跟这些残基发生多硫化反应,改变活性中心结构导致底物无法结合,从而阻断糖酵解通路。5.亚铁导致细菌铁死亡相关指标的检测:如脂质过氧化物,GSH/GSSG以及通过螯合剂去除亚铁观察D-Fe3S4抗菌性的改变。通过以上研究表明,亚铁引起细菌铁死亡,与多硫化物介导的能量代谢阻断效应协同作用杀死G.vaginalis。第四部分,硫化铁纳米酶协同乳酸杆菌治疗小鼠耐药G.vaginalis阴道炎硫化铁纳米酶具有POD酶活,而乳酸杆菌可以分泌H2O2,利用二者特性联合治疗,深入研究D-Fe3S4在生物体内联合微生态恢复制剂Lactobacillus对BV的治疗作用。首先,体外条件下,研究单独Lactobacillus对G.vaginalis生物膜的干扰实验及Lactobacillus联合D-Fe3S4对G.vaginalis生物膜的治疗实验。其次,通过建立小鼠BV模型,评估了 D-Fe3S4纳米及D-Fe3S4栓剂对小鼠BV的确切防治效果;进一步,通过小鼠耐甲硝唑BV模型实验进一步证明了 D-Fe3S4与Lactobacillus联合治疗效果。此外,还对100例临床BV患者阴道分泌物病原菌验证D-Fe3S4杀菌效果。考虑到体内应用安全性问题,我们检测了D-Fe3S4对VK2细胞的生物相容性;D-Fe3S4及其释放成分多硫化物和亚铁对Lactobacillus生物相容性;检测了 D-Fe3S4释放上清对3种哺乳动物细胞（VK2、RAW264.7和Hacat）的生物安全性;检测了连续7天阴道给予D-Fe3S4后,对小鼠心肝脾肺肾、阴道、子宫等组织病理变化以及体重监测。综上所述,实验设计确定了硫化铁纳米酶在富营养条件下抗菌过程中作用规律和具体作用机制,发现亚稳态铁硫化物（mFeS）,特别是D-Fe3S4,对G.vaginalis有革兰依赖的特异性的选择性抗菌作用,抗菌机制研究发现D-Fe3S4释放的多硫化物能够快速进入菌壁较薄的G.vaginalis内部对糖酵解代谢通路中的关键酶GLK产生抑制作用,阻断糖酵解通路。另一方面,释放的亚铁引起细菌铁死亡与多硫介导的能量代谢阻断效应协同杀死G.vaginalis,确定了 D-Fe3S4联合微生态恢复制剂Lactobacillus对耐药BV的治疗作用,可作为强有力的BV治疗的抗菌候选材料。本研究结果将有助于表明D-Fe3S4是一类有效防治BV的非抗生素类药物,为BV治疗提供了一个潜在的应用前景。