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目的:MicroRNA(miRNA)是一类长约19~22个核苷酸的内源性单链非编码RNA,广泛存在于动植物和病毒中,通过与靶基因m RNA完全或非完全碱基互补配对在转录后水平调控基因的表达。miRNA广泛参与调控机体的发育和各种内稳态事件。大量研究表明miRNA可以通过调控与成脂分化相关的许多转录因子来影响骨髓间充质干细胞的成脂分化。在本室的前期研究中我们已经证实miR-20a-5p可以通过靶向赖氨酸特异性去甲基化酶6b(lysine-specific demethylase 6b,Kdm6b)和转化生长因子-β受体II(transforming growth factor beta receptor II,Tgfbr2)促进ST2骨髓基质细胞系及C3H10T1/2间充质干细胞系的成脂分化。然而,其在调控小鼠原代骨髓间充质干细胞(bone marrow derived stromal cells,BMSCs)成脂分化中的作用和分子机制尚不完全清楚。本研究将探讨miR-20a-5p对小鼠原代BMSCs成脂分化的影响,并进一步阐明其发挥作用的分子机制。方法:1、分离并培养小鼠原代BMSCs,进行成脂诱导后,收集不同分化时间点的细胞并提取RNA,采用RT-q PCR技术检测miR-20a-5p及成脂分化标志性基因的表达;包装miR-20a-5p过表达慢病毒和sponge慢病毒,通过感染慢病毒及转染miR-20a-5p mimics/inhibitor提高或降低miR-20a-5p的表达,利用RT-q PCR、Western blotting和油红O等技术检测miR-20a-5p对小鼠BMSCs成脂分化的影响。2、利用靶基因预测软件Target Scan预测miR-20a-5p的靶基因,采用双荧光素酶报告基因分析、GFP报告基因实验及Western blotting技术对候选靶基因Krüppel样转录因子3(Krüppel-like factor 3,Klf3)进行鉴定,并通过功能获得性及缺失性实验检测miR-20a-5p对Klf3和KLF(Krüppel-like factors)家族其他两个成员表达的影响。3、利用拯救实验探究miR-20a-5p在成脂分化中发挥调控功能的作用机制。此外,同时过表达Klf3、Kdm6b和Tgfbr2(后两者已证实为miR-20a-5p的靶基因),采用RT-q PCR和油红O染色技术检测对miR-20a-5p调控BMSCs成脂分化的影响。结果:1、miR-20a-5p及成脂标志性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCATT/增强子结合蛋白α(CCATT/enhancer binding protein alpha,C/EBPα)和脂肪酸结合蛋白4(adipose fatty acid binding protein 4,FABP4或a P2)在小鼠BMSCs诱导成脂分化过程中表达显著提高,且miR-20a-5p在成脂分化前3天表达量逐渐升高,此后2天仍保持较高的表达水平。2、miR-20a-5p过表达慢病毒及miR-20a-5p mimics均可以提高小鼠BMSCs中miR-20a-5p的水平,促进BMSCs的成脂分化,且上调成脂标志性基因PPARγ、C/EBPα和a P2蛋白水平。相反,miR-20a-5p sponge慢病毒及miR-20a-5p inhibitor均可以降低小鼠BMSCs中内源miR-20a-5p的水平,抑制BMSCs的成脂分化,同时下调成脂分化过程中关键基因PPARγ、C/EBPα和a P2蛋白表达水平。3、根据靶基因预测软件Target Scan预测结果,选定Klf3为miR-20a-5p的候选靶基因,并成功将Klf3基因3’UTR区包含miR-20a-5p结合位点的序列及其突变型片段插入荧光素酶/GFP报告基因载体。在双荧光素酶报告基因分析实验中,miR-20a-5p mimics使Klf3-3’UTR报告基因的荧光素酶活性显著下降;在GFP报告基因分析实验中,miR-20a-5p mimics同样使Klf3-3’UTR GFP报告基因的GFP表达量显著降低。此外,在小鼠BMSCs中,上调miR-20a-5p的水平会抑制Klf3的m RNA和蛋白水平表达;相反,下调miR-20a-5p的水平则促进Klf3的m RNA和蛋白水平表达,因此,提示Klf3是miR-20a-5p的直接靶基因。4、miR-20a-5p的过表达或敲减影响Klf3表达的同时,不影响KLF家族其它成员Klf5和Klf7基因的表达。5、Klf3的沉默表达可以促进小鼠BMSCs向脂肪细胞分化,与miR-20a-5p过表达的作用相同;拯救实验结果显示与单独过表达Klf3相比,同时过表达mimics和Klf3,BMSCs的成脂分化被促进;与单独过表达mimics相比,同时过表达mimics和Klf3,BMSCs的成脂分化被抑制。miR-20a-5p可以减弱Klf3的抑成脂作用,提示miR-20a-5p可通过抑制Klf3发挥促进成脂分化的作用。6、与miR-20a-5p mimics和Klf3共转染组相比,miR-20a-5p mimics和Klf3、Kdm6b、Tgfbr2共转染组中BMSCs向脂肪细胞分化的数量明显减少,且成脂标志性基因PPARγ、C/EBPα、a P2 m RNA的表达均下调。结论:1、miR-20a-5p在小鼠BMSCs成脂分化过程中表达上调。2、在BMSCs中提高miR-20a-5p的水平可以促进其成脂分化;相反,在BMSCs中下调miR-20a-5p的水平可以抑制其成脂分化。3、Klf3是miR-20a-5p的靶基因,Klf5和Klf7在miR-20a-5p影响Klf3表达过程中无明显补偿效应。4、Klf3可以抑制BMSCs的成脂分化,miR-20a-5p可以靶向抑制Klf3促进BMSCs向脂肪细胞分化。5、与单独的Klf3相比,Klf3、Kdm6和Tgfbr2三者能更有效的减弱miR-20a-5p的促成脂作用。