论文部分内容阅读
研究目的1.研究抑癌基因WTX和β-catenin、P-gp在不同生存期胃癌患者肿瘤组织中的表达情况及三者之间的相关性；建立Logistic回归模型,分析影响胃癌预后的因素。2.构建过表达WTX的慢病毒载体,以高表达P糖蛋白(P-gp)的MDR胃癌细胞SGC7901/VCR为模型,研究WTX对P-gp表达水平的影响。3.初步研究WTX调控P-gp表达的机制,并研究WTX对耐药胃癌细胞SGC7901/VCR的影响。方法1.按生存时间的不同分为预后良好组(生存期>5年)和预后不良组(2年内因肿瘤进展死亡),分别取肿瘤和正常组织石蜡切片进行免疫组化染色。检测WTX、β-catenin和P-gp在不同生存期胃癌患者肿瘤组织中的表达情况及其之间的相关性。建立Logistic回归模型,分析影响胃癌预后的相关因素。2.构建过表达WTX的慢病毒载体,观察绿色荧光蛋白表达情况,qPCR检测WTX mRNA表达水平。qPCR检测分析WTX、mdr-1、MRP-1、BCRP在SGC7901和SGC7901/VCR细胞的表达情况。将SGC7901/VCR细胞分为细胞对照组(CON组)、阴性对照组(NC组)和WTX过表达组(OE组)。慢病毒感染SGC7901/VCR, qPCR和Western blot检测过表达WTX后SGC7901/VCR细胞中P-gp的表达情况。3. SGC7901/VCR细胞分组后感染慢病毒,qPCR检测过表达WTX前后β-catenin、TCF4、CBP、p300、TP53、MDM2、NF-κB、E-cadherin、c-myc和cyclinD1的变化,初步探讨WTX对P-gp的调控机制。同时研究WTX对MDR胃癌细胞生长的影响：流式细胞Annexin V/PI染色检测细胞凋亡率;CCK8法检测细胞增殖活性并绘制细胞生长曲线：流式细胞测定细胞周期。结果1.预后良好组中WTX表达水平高于预后不良组,而β-catenin和P-gp表达水平低于预后不良组。相关性分析显：WTX表达水平与β-catenin和P-gp表达水平呈负相关关系,而β-catenin和P-gp表达水平间为正相关关系。通过建立Logistic回归模型,由通过检验可以得到如下变量：年龄、TMN分期、WTX评分、β-catenin评分和P-gp评分。结果如下：(1)年龄：年龄(1)和年龄(2)表示以青年组(<40岁)为参照,分别用中年组(≥40岁—<60岁)和老年组(≥60岁)与青年组相比较。结果显示B值为负数,且Exp(B)<1,年龄因素和预后呈负相关关系,即年轻的患者预后较老年患者差。(2)TNM分期：B值为正数,且Exp (B)>1,显示TNM分期和疾病预后呈正相关关系,即TNM分期增加,则预后不良。OR=12.76,95%置信区间为：1.119-145.435。(3)WTX评分：B值为负数,且Exp (B)<1,WTX评分与预后呈负相关关系,即评分越高,预后越好。(4) β-catenin评分：B值为正数,且Exp (B)>1, β-catenin评分与预后呈正相关关系,即评分越高,预后越差。OR=12.872,95%置信区间为：1.524-108.72。(5)P-gp评分：B值为正数,且Exp (B)>1, P-gp评分与预后呈正相关关系,即评分越高,预后越差。2.成功构建WTX慢病毒表达载体,qPCR检测发现SGC7901和SGC7901/VCR中WTX均为低表达;P-gp在SGC7901中低表达而在SGC7901/VCR中高表达；MRP-1和BCRP在SGC7901和SGC7901/VCR中均为高表达。qPCR检测SGC7901/VCR感染慢病毒后,WTX mRNA升高了108.9倍,成功过表达WTX; qPCR和Western blot检测过表达WTX后mdr-1 mRNA和P-gp蛋白表达均下调。3. qPCR检测过表达WTX后：TCF4、p300和NF-κB的mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)；仅c-myc表达下调(P<0.05); β-catenin、CBP、 TP53、MDM2、E-cadherin和cyclinD1均为上调,差异有统计学意义(P<0.05)。提示WTX可能通过p53途径调控P-gp,且WTX抑制c-myc表达,并对细胞间粘附和细胞周期产生影响。流式细胞检测未发现细胞出现明显凋亡；CCK8法检测SGC7901/VCR细胞生长曲线,发现过表达WTX后SGC7901/VCR细胞增殖受到抑制；进一步用流式细胞术检测显示细胞周期阻滞于S期。结论1. WTX、β-catenin和P-gp表达水平均与胃癌预后相关：WTX表达水平与胃癌预后呈负相关关系,而β-catenin和P-gp表达水平与胃癌预后呈正相关关系。年龄、TMN分期、WTX评分、β-catenin评分和P-gp评分是影响胃癌预后的因素。2. SGC7901/VCR细胞高表达P-gp,是研究P-gp介导的MDR的良好模型。过表达WTX可以降低SGC7901/VCR细胞P-gp的mRNA和蛋白表达水平。3.WTX可能通过p53途径调控P-gp,抑制c-myc表达,并对细胞间粘附和细胞周期产生影响。过表达WTX后未出现明显的SGC7901/VCR细胞凋亡是通过诱导S期阻滞抑制细胞增殖。