肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）、生长分化因子 11（Growth Differentiation Factor 11）、激活素（Activins）是动物体内几种游离的TGF-β家族蛋白,广泛存在于血清中。在肌肉组织中,这几种游离的蛋白发挥作用的主要形式是通过与细胞膜上的激活素受体ⅡA（ActRⅡA）和激活素受体ⅡB（ActRⅡB）结合,进一步促进下游信号通路和相应靶基因的表达,从而抑制肌肉生长发育。研究表明,使用CRISPR-Cas9全身性突变Myostatin可以有效促进肌肉生长,但突变的Myostatin游离于机体的各个部位,会对其他组织产生影响,例如损害免疫系统,增加死亡率以及高血压心脏病等疾病的风险。因此,本实验使用AAV9-SaCas9-sgRNA局部敲除肌肉组织中ActRⅡA和ActⅡB,探索更为安全的促进肌肉生长的方法。本研究进行了以下实验:（1）本研究分别在ActRⅡA和ActRⅡB的编码区上设计8个sgRNA,构建相应的pX601-SaCas9-sgRNA重组载体。使用lipo3000转染,将构建好的重组载体转染至小鼠的肌肉细胞系C2C12。转染后48h后,采用T7EI酶切和测序的手段检测编辑效率,初步筛选具有活性的sgRNA。（2）荧光报告载体辅助筛选,验证sgRNA敲除活性:lipo3000转染目的质粒的阳性率与细胞状态密切相关,研究表明使用荧光报告载体共转染,带荧光的细胞具有更高的目的质粒转染效率。使用与pX601-saCas9-sgRNA载体长度相近的红色荧光报告载体,将两个质粒共转染至C2C12中,转染48小时后,流式细胞分选富集红色荧光阳性的细胞。采用T7EI酶切和测序的手段,进一步确认sgRNA敲除活性。（3）将筛选得到的 pX601-SaCas9-sgRNA 包装成 AAV9（Adeno-associated virus）,感染四周大的C57BL/6小鼠左腿胫骨前肌（Tibialis anterior,TA）,8周后采样,并提取基因组DNA,以T7EI酶切法和测序法检测ActRⅡA和ActRⅡB基因编辑效率,通过免疫荧光染色检测小鼠肌纤维面积的变化。结果表明:（1）成功构建了靶向ActRⅡA和ActRⅡB的编码区的16个pX601-SaCas9-sgRNA重组载体,采用Lipo3000转染成功筛选并得到了 pX601-SaCas9-ActRⅡA-sgRNA3和pX601-SaCas9-ActRⅡB-sgRNA4重组载体,可在细胞水平突变ActRⅡA和ActRⅡB基因。但由于pX601-saCas9-sgRNA重组载体骨架较大,只有10%-20%的转染效率,通过T7EI酶切仅检测到较弱的突变效率,测序未见双峰。（2）荧光报告载体辅助筛选,成功在测序的峰图上检测到ActRⅡA和ActRⅡB基因的突变。（3）将 pX601-SaCas9-ActRⅡA-sgRNA3和pX601-SaCas9-ActRⅡB-sgRNA4 包装成AAV9腺相关病毒,感染一月龄的C57BL/6小鼠TA,T7EI酶切检测到ActRⅡA和ActRⅡB基因的突变。通过免疫荧光染色发现注射AAV9重组腺相关病毒后,实验组小鼠的肌纤维面积相对对照组小鼠显著增大。本研究通过使用AAV9介导的方法局部敲除小鼠胫骨前肌中ActRⅡA和AcRⅡB基因,在不影响其他组织器官正常发育的情况下,成功诱导ActRⅡA和AcRⅡB基因发生一定程度突变,引起肌纤维面积发生了明显增加。验证了 ActRⅡA和ActRⅡB基因在动物肌肉生长发育中的作用,为培育高产肉家畜和促进畜牧业发展提供一个全新的视角,同时也为治疗肌肉萎缩、肌少症等与肌肉相关的疾病提供依据。