肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）是一种重要的人兽共患病原菌,可引起人的尿路感染、脑膜炎、败血症等,在动物中可以引起禽和牛的肠外感染甚至死亡。近年来,ExPEC在猪群中逐渐流行,感染后导致猪的脑膜炎、肺炎和败血症等严重疾病,对养猪业造成严重危害。目前,尚无针对猪ExPEC的疫苗,而传统的抗生素治疗因耐药性问题往往效果不佳,有效的防治策略和手段亟待开发。病原菌利用特定的毒力因子或体内适应性因子促进其体内存活和致病,因此深入挖掘病原菌的致病相关因子,揭示这些因子在感染过程中的作用对理解病原菌的致病机理至关重要,对新型抗菌药物和疫苗靶标发现具有重要理论意义。目前,我们对猪ExPEC的了解还不够深入,对其致病机理研究不够充分。传统的毒力因子鉴定方法效率低、工作量大,且难以发现新毒力因子。因此,本研究利用转座子随机插入的特性构建了猪ExPEC转座突变体文库,利用小鼠模型和转座插入测序技术（TraDIS）鉴定了猪ExPEC全基因组范围内的体内适应性因子和血清存活因子,并针对重要基因进行了验证,取得了以下主要研究结果:1.构建了基于Mariner转座酶的随机转座突变体体系,利用接合转移成功在临床分离强毒株ExPEC PCN033中实现了随机转座突变。利用该转座突变体系,构建了ExPEC PCN033菌株的转座突变体文库,该文库包含约68000个单克隆转座突变体。对该文库进行高通量测序发现该文库中含有转座子插入的基因数量占整个基因组编码基因的72%。因此,本研究成功构建了一个接近饱和的ExPEC PCN033随机突变体文库。2.利用该ExPEC转座子突变体库（Input）感染小鼠,12小时后分别分离脑、脾、肺组织中的细菌（Output）,对文库进行高通量测序,比较Input文库和Output文库中各个基因转座子插入频率,共鉴定脑组织中差异基因100个,脾组织中差异基因83个,肺组织中差异基因92个。其中在两种及以上组织中均鉴定出的ExPEC差异基因64个,KEGG富集分析发现在筛选的基因中有42个基因位于代谢通路中,其中有6个基因位于膜转运途径,COG功能聚类分析发现在离子通道和细胞壁结构相关的基因比例较高,分别包含11个和5个基因。3.进一步对上述筛选到的ExPEC PCN033体内适应性因子进行了验证,共构建23个基因缺失突变体,实验发现rfa操纵子缺失可能通过影响细菌在血清中的存活能力,进而影响ExPEC在小鼠体内的定植能力;ΔfimG显著降低了ExPEC对上皮细胞的黏附能力以及在小鼠体内的定植能力,是ExPEC的重要的体内适应性因子;代谢相关基因fepB,sdhC,malM等缺失后通过影响ExPEC不同的代谢功能进而影响其在小鼠体内的定植能力;调控相关基因baeS,metJ缺失后,降低了ExPEC在小鼠体内的定植能力,对上皮细胞的黏附能力以及抵抗巨噬细胞吞噬能力,是参与ExPEC致病机制的重要因子。4.利用上述构建的ExPEC PCN033转座子突变体库筛选了血清处理前后转座子插入频率差异基因,筛选出与血清存活相关基因32个。构建了ExPEC PCN033菌株中单质粒CRISPRi基因表达沉默系统,并验证发现xylF,torC,PPECC33＿RS04820等基因与ExPEC PCN033血清存活相关。本研究成功构建了ExPEC PCN033菌株的转座突变体文库,利用TraDIS技术在全基因组范围内挖掘了ExPEC的体内适应性因子和血清存活相关基因,探究了相关基因在ExPEC致病过程中的作用,为深入理解ExPEC致病机制和挖掘新型抗菌药物靶标奠定了基础。