【摘 要】
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肌内脂肪和肉品品质及风味密切相关,研究表明Wnt信号通路通过抑制前脂肪细胞的分化、Hedgehog信号途径通过阻断多能间充质细胞向脂肪细胞的分化来影响肌内脂肪的形成。模拟肌内脂肪细胞形成的环境是研究肌内脂肪形成的基础,目前已有研究大多是对单一细胞进行分析,但肌内脂肪环境下既存在肌细胞又存在脂肪细胞,利用单一的细胞并不能很好的模拟肌内脂肪形成的环境。Transwell小室共培养是近年来新兴的间接培养
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肌内脂肪和肉品品质及风味密切相关,研究表明Wnt信号通路通过抑制前脂肪细胞的分化、Hedgehog信号途径通过阻断多能间充质细胞向脂肪细胞的分化来影响肌内脂肪的形成。模拟肌内脂肪细胞形成的环境是研究肌内脂肪形成的基础,目前已有研究大多是对单一细胞进行分析,但肌内脂肪环境下既存在肌细胞又存在脂肪细胞,利用单一的细胞并不能很好的模拟肌内脂肪形成的环境。Transwell小室共培养是近年来新兴的间接培养方法,可以在物理分开的基础上在体外探究两种细胞间的相互作用。肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种肌细胞分泌的肌肉生长负调节因子,前期利用单一脂肪间充质干细胞的研究表明MSTN可以影响肌内脂肪形成,但在既有肌细胞又有前脂肪细胞的情况下MSTN如何发挥作用并不清楚。因此本试验用Transwell小室对C2C12细胞和3T3-L1细胞进行共培养来模拟肌内脂肪形成的环境,经MSTN处理后检测3T3-L1细胞的变化,从而研究MSTN对肌内脂肪形成的影响。主要研究结果如下:1.Transwell小室共培养体系的建立已诱导分化的C2C12细胞用于模拟肌肉组织中的肌细胞,3T3-L1细胞用于模拟肌肉组织中的前脂肪细胞。用Transwell小室构建共培养环境,上为C2C12细胞,下为3T3-L1细胞。以单独培养的3T3-L1细胞为对照。两个组用成脂诱导培养基DIM处理,结果显示共培养后的3T3-L1细胞中PPARγ的表达量极显著降低（P＜0.01）,形成的脂滴也有所减少。说明与C2C12细胞共培养后3T3-L1细胞的成脂能力受到了抑制。该表型与动物个体的肌肉组织中的脂肪细胞个体小、数量少的表型相一致。将接有3T3-L1细胞的Transwell小室插入接有C2C12细胞的细胞培养板中进行共培养,以单独培养的C2C12细胞为对照。两个组用成脂诱导培养基DIM处理,结果显示共培养后的C2C12细胞中PPARγ的表达量极显著降低（P＜0.01）,形成的脂滴也有所减少。说明与3T3-L1细胞共培养后抑制了C2C12细胞的成脂。以上表明我们构建的共培养体系中两种细胞在物理隔离的状态下细胞间因子可以相互影响,符合试验预想。说明我们的共培养体系可以用于模拟肌内环境,可用于后面对于肌内环境下MSTN对于肌内脂肪形成的影响的研究。2.共培养条件下,MSTN抑制了3T3-L1细胞中PPARγ的表达用Transwell小室构建上室为C2C12细胞下室为3T3-L1细胞的共培养体系,试验组用含有100 ng/m L MSTN的细胞培养基处理,对照组用普通培养基,两组同时处理48 h。结束后用成脂诱导培养基DIM诱导,油红O染色后两组3T3-L1细胞均出现脂滴。Q-PCR结果显示对照组3T3-L1细胞中PPARγ的表达量极显著高于试验组（P＜0.01）。说明共培养条件下MSTN抑制了3T3-L1细胞中PPARγ的表达。3.共培养条件下,MSTN对两信号通路的影响用本试验构建的Transwell小室共培养体系进行3T3-L1细胞和C2C12细胞共培养,用含MSTN的培养基处理48h,在0h、12h、24h、48h四个时间点收取3T3-L1细胞进行Q-PCR与WB,检测两信号通路的变化。Q-PCR检测结果发现Wnt信号通路中的基因c-Myc、Cyclin D1、Wisp2表达量降低（P＜0.05）,Axin2表达量升高（P＜0.05）。WB结果显示Smad2和Smad3的磷酸化水平极显著降低（P＜0.01）,c-Myc的磷酸化水平极显著降低（P＜0.01）,Wisp2的蛋白表达量也极显著降低（P＜0.01）。说明共培养条件下MSTN的处理降低了Wnt信号通路的活性。同时Hedgehog信号通路中的基因Smo、Gli2发生显著下调（P＜0.05）,Gli1在蛋白水平的表达量极显著降低（P＜0.01）,Smo的磷酸化水平极显著下调（P＜0.01）。说明共培养条件下MSTN的处理降低了Hedgehog信号通路的活性。结论:（1）本试验构建的Transwell小室共培养体系可以很好的模拟肌内脂肪形成的环境,可用于研究肌内脂肪的形成。（2）在与C2C12细胞共培养条件下,MSTN的处理会减弱3T3-L1细胞中Wnt信号通路的活性。（3）在与C2C12细胞共培养条件下,MSTN的处理会减弱3T3-L1细胞中Hedgehog信号通路的活性,有利于3T3-L1细胞的成脂。
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