脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）后出现代谢紊乱、炎症反应、局部缺血、神经元死亡等一系列继发性损伤，加上中枢神经自身再生能力有限，这些都成为脊髓损伤治疗中难以克服的障碍。尽管脊髓的原发性损伤是不可逆转的，但继发性损伤却是一个动态调控、可被逆转的过程，因此也为人们提供了有效时机来挽救受损神经元，最大程度减轻SCI带来的灾难性后果。发展神经保护剂，通过药物对继发性损伤的不同病理过程进行干预，尽可能保护受损的神经元以及促进受损神经元的再生是目前脊髓损伤治疗的主要方向之一，选择安全有效的治疗药物对SCI的预后起着至关重要的作用。鹿瓜多肽（Cervus and cucumis polypeptide, CCP）是由梅花鹿的骨骼和干燥的甜瓜籽制成的一种中药复合制剂，在临床上被广泛应用于骨折、骨质疏松、疼痛、类风湿性关节炎等疾病的治疗，疗效显著，无明显不良反应。其成分中包含着TGF-β，BMP，FGF等活性因子，它们参与了细胞的分化，缓解炎症反应，改善微循环以及刺激血管内皮细胞增殖和促进新生血管形成等诸多环节。脊髓损伤后出现的多种病理过程都能与鹿瓜多肽的治疗靶点相匹配。因此我们设想：CCP是否可以用于脊髓损伤的治疗以及该药物的主要作用对象和影响的主要病理过程有哪些？为此我们设计了以下实验：实验一：鹿瓜多肽对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的作用旷场实验：所有大鼠脊髓损伤模型采用中度脊髓夹伤模型。CCP治疗后4d，BBB平均分值为12.6±0.86，明显高于对照组（9.5±0.83）（p<0.01）；此时大鼠已经能够持续负重行走，并伴有偶发的前后肢协调运动。SCI后7d，CCP治疗组大鼠后肢运动恢复的速度（16.7±0.87）显著高于对照组（13.7±0.56）（p<0.05），动物表现为持续的前后肢协调运动。但在SCI后14d，动物后肢运动恢复的程度在CCP处理组（18.0±0.56）和对照组(16.3±1.02)已无明显的统计学差异（p>0.05）。足迹实验：脊髓损伤后5d，对照组大鼠后肢Toe dragging高达34.6%，与CCP治疗组（9.6%）相比，具有显著统计学差异(p<0.001)。至7d时，CCP组Toe dragging为5%，与对照组（10%）已无显著统计学差异（p>0.05）。SCI后7d，对照组和CCP组大鼠均开始负重步行。对照组大鼠步长11.64±0.39cm，步宽4.69±0.21cm，CCP可增加大鼠步长12.98±0.22cm，具有显著统计学差异（p<0.001），但步宽（4.22±0.20cm）和对照组相比无统计学差异（p>0.05）。CCP治疗后7d的TS1-5为1.632±0.011mm，TS2-4为0.816±0.065mm，与生理盐水对照组相比（TS1-5为1.744±0.064mm，TS2-4为1.092±0.091mm），可明显减少1-5和2-4趾间的距离，具有统计学差异（p<0.05）。这部分实验显示：鹿瓜多肽在大鼠脊髓中度夹伤后可以促进早期运动功能的恢复。实验二:鹿瓜多肽促进脊髓损伤后神经元的存活存活神经元：根据GFAP标记的损伤区域，以损伤区域为中心，分别向吻、尾两侧各连续取2个连续的1mm区域作为评估存活神经元区域，从吻侧向尾侧方向分别标记为R2、R1、C1、C2区。我们首先评估了脊髓夹伤后7d时R1和C1区内总的NeuN阳性神经元数目。对照组为1316±120个，CCP处理组为1824±130个，两组之间存在显著性差异（p<0.05）。脊髓夹伤后14d，对照组为1015±244个，CCP组为1699±177个，两组之间存在显著性差异（p<0.05）。此外又分别比较了对照组和CCP组R2, R1, C1和C2四个区域在7d时间点的神经元数目，仅在R1区两组之间存在显著性差异（614±103vs928±56, p<0.05）。脊髓损伤后14d，也仅在R1区两组之间存在显著性差异（555±121vs885±76, p<0.05）。上述实验说明：CCP可以促进邻近脊髓损伤区的神经元存活。提示：促进神经元存活可能是CCP有利于脊髓损伤功能恢复的原因之一。实验三：鹿瓜多肽促进脊髓损伤后的血管再生RECA~+血管面积：同实验一对神经元计数的划分区域，分别计数了R2、R1、C1和C2区内RECA~+血管面积。脊髓夹伤后7d，生理盐水对照组在R2, R1, C1, C2四个区域的RECA~+面积（mm~2）分别为0.076±0.006,0.074±0.003,0.065±0.002和0.059±0.009，给予CCP处理后，各区域面积分别为0.139±0.007,0.133±0.010,0.143±0.010和0.099±0.008。CCP治疗组4个区域的RECA~+面积与对照相比均有显著增加，具有统计学差异（p<0.05）。SCI后14d，CCP可以增加R1区（0.184±0.015）和C1区（0.156±0.008）RECA~+面积，与生理盐水组相应区域R1（0.121±0.015）和C1（0.105±0.015）相比具有统计学差异（p<0.05），但对R2和C2区RECA~+血管面积无影响。R1区内7d和14d时存活神经元的数量与RECA~+血管面积呈良好的线性正性相关。VEGF mRNA水平在脊髓损伤后7d和14d出现一定程度下降。7d时夹伤组VEGF的相对表达量为0.00517±0.00056，给予CCP后VEGF mRNA水平明显增加，其相对表达量达0.00759±0.00065，与对照组相比具有统计学差异（p<0.05）。至14d时，对照组VEGF mRNA水平仍保持在较低水平（0.00647±0.00021），CCP组VEGF mRNA水平（0.00883±0.00065）仍显著高于对照组，两组之间存在统计学差异（p<0.05）。CD31mRNA水平较假手术组正常大鼠（0.00341±0.00072）升高，7d和14d时的相对表达量分别为0.00484±0.0006和0.00492±0.00093。给予CCP治疗后，CD31mRNA表达明显增加，7d和14d的相对表达水平为0.00759±0.00072和0.00835±0.00066，与对应时间点生理盐水对照组和假手术组相比均具有统计学差异（p<0.05）。假手术组VEGF受体Flk-1mRNA相对表达量为0.00134±0.00060。脊髓夹伤后7d和14d时的相对表达量分别为0.00211±0.00032和0.00162±0.00018，给予CCP后可明显增加FLK-1mRNA的表达水平，对应7d和14d的相对表达量分别为0.00430±0.00063和0.00308±0.00028，具有统计学差异（p<0.05）。VEGF另一受体Flt-1mRNA表达水平在假手术组为0.00319±0.00124，脊髓损伤后7d和14d时的mRNA相对表达量与对应CCP治疗组相比无统计学差异（0.00523±0.00098vs0.00557±0.00137,0.00553±0.00065vs0.00519±0.00085, p>0.05）。该部分实验证明CCP可以促进损伤旁区血管发生，增加的RECA~+血管面积与存活神经元之间具有高度的正性线性关系。CCP可以增加VEGF、CD31以及VEGF受体Flk-1mRNA表达水平，即CCP可能通过VEGF-VEGFR-2途径发挥受损脊髓损伤旁区的促血管生成作用。实验四鹿瓜多肽促进星形胶质细胞增生GFAP染色：脊髓夹伤后4、7和14d，生理盐水对照组的损伤区面积分别为2.06±0.27,1.60±0.15和1.16±0.28mm~2。CCP可明显减少4d时的损伤区面积到1.23±0.15mm~2，7d时的损伤区面积到1.1±0.15mm~2（p<0.05）。SCI后14d，CCP处理组的损伤面积（0.93±0.22mm~2）与对照组已无明显差异（p>0.05）。与此同时，也降低了相应4d和7d时GFAP的蛋白表达水平（p<0.05），14d时对照组和CCP组的GFAP水平无差异（p>0.05）。体外培养的星形胶质细胞增殖实验：MTT显示：CCP可以有效促进星形胶质细胞的活力和增殖；同样流式细胞检测发现：CCP可以显著提高处于S期和G2/M期星形胶质细胞的比例。以上结果均提示CCP可以促进星形胶质细胞的增殖。星形胶质细胞体外划伤的连续72小时观察实验显示：CCP可以显著促进星形胶质细胞迁移，减小划伤面积。提示：CCP在脊髓损伤的早期阶段活化星形胶质细胞，促进GFAP的表达，加速细胞迁移，缩小损伤区面积，促进伤口愈合。小结：通过以上的研究，CCP可以通过VEGF，CD31和VEGFR2（Flk-1）表达的升高促进血管发生，挽救损伤周边区神经元，促进运动功能的恢复。除此之外，CCP可以激发损伤早期星形胶质的活性，包括GFAP水平的升高，限制损伤区炎症扩散，促进伤口的愈合，最终达到脊髓损伤后从结构到功能的统一治疗效果。