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目的： TNFα在经氨基半乳糖(D-Gal)/脂多糖(LPS)诱导产生的急性肝损伤(ALI)中扮演关键角色。本研究拟利用ALI小鼠模型，验证新型TNFα拮抗剂sTNFRII-gAD融合蛋白的护肝效应，并阐明相应的作用机制。 方法： 1.D-Gal/LPS诱导的急性肝损伤模型的建立 BALB/c小鼠隔夜禁食后经腹腔注射D-Gal/LPS混合液，注射等量生理盐水组作为阴性对照，连续观察12h。 2.sTNFRII-gAD融合蛋白对D-Gal/LPS诱导的小鼠急性肝损伤的疗效观察 1)小鼠生存率分析:将小鼠随机分为四组，即正常组、LPS/D-Ga1+PBS组（阴性对照）、LPS/D-Gal+sTNFRII-Fc组（阳性对照）、D-Gal/LPS+sTNFRII-gAD组。部分小鼠(N=6)注射D-Gal/LPS后立即治疗;另一部分小鼠(N=6)注射D-Gal/LPS1 h后治疗，连续观察12h，记录各组小鼠的生存率。 2)血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的检测:治疗后2h、5h分别检测各组ALT、AST的变化。 3)肝脏组织HE染色:治疗后5h处死小鼠，立即取肝脏用10％中性甲醛溶液固定过夜，苏木素-伊红染色观察经sTNFRII-gAD治疗后，ALI肝脏组织病理学变化。 3.sTNFRII-gAD融合蛋白对D-Gal/LPS诱导的ALI治疗机制研究 1)血清TNFα含量及活性分析:D-Gal/LPS建模，治疗后2h、5h采血分别用ELISA测定血清TNFα含量，及其杀伤L929细胞活性。 2)血清中sTNFRII-gAD-TNFα复合物分析:建模并经治疗后5h采血，双抗体夹心法检测sTNFRII-gAD治疗组血清sTNFRII-gAD-TNFα复合物。 3)肝脏Caspase-3测定:治疗后5h处死小鼠，立即取适量肝脏组织，Westernbloting检测Caspase-3。 4) TUNEL法检测细胞凋亡:治疗后5h处死小鼠，立即取肝脏组织经10％甲醛固定过夜，制备石蜡切片，TUNEL法观察各组肝脏细胞凋亡情况。 4.数据的统计学分析。 实验结果用平均值±标准差表示，对于多组间的同一时间点的比较，我们用One-way ANOVA统计学方法。方差齐时，用Welch法进行校正，两两之间的比较，采用Bonferroni法;方差不齐时，则采用Dunnetts T3法。生存分析用Kaplan-Meier法，多重比较用Kruskal-Wallis H非参数检验。最后，用SPSS统计软件进行分析，当P＜0.05表示有统计学意义。 结果： 1.sTNFRII-gAD显著改善ALI小鼠的生存率 造模后立即治疗，PBS组造模后4.5-7 h全部死亡;sTNFRII-Fc组死亡主要出现在造模6h以后，其12h生存率大约64％;而sTNFRII-gAD组生存率达100％。造模后1h给予治疗，sTNFRII-Fc组12h存活率为33.3％，大多数死亡发生在治疗后5-7 h;而sTNFRII-gAD组12h生存率达66.7％，并且死亡集中在治疗后8h;与PBS组比较，sTNFRII-Fc组和sTNFRII-gAD组生存率均显著升高，并具有统计学意义(PsTNFRII-Fc=0.009;PsTNFRII-gAD=0.001);而sTNFRII-Fc组和sTNFRII-gAD组之间差异则无统计学意义(P=0.127)。 2.sTNFRII-gAD能有效减轻肝损伤 血清ALT/AST水平用于评估急性肝损伤的程度。D-Gal/LPS诱导后2小时，这两种转氨酶升高不明显，但5小时后则在所有D-Gal/LPS处理的小鼠血清均能检测到。与PBS对照组相比，sTNFRII-Fc和sTNFRII-gAD治疗组血清AST/ALT水平显著降低(P＜0.01)。 此外，sTNFRII-Fc和sTNFRII-gAD均能有效减轻肝肿大程度(P＜0.01)，尤其是sTNFRII-gAD治疗组。sTNFRII-Fc治疗组肝脏明显肿大，但明显比PBS组轻;而sTNFRII-gAD治疗组则肝脏无明显肿大，与正常肝脏相似。 H-E染色显示，在PBS组，D-Gal/LPS能诱发小鼠肝脏组织结构广泛破坏、红细胞凝集和局灶性坏死;而在sTNFRII-gAD或sTNFRII-Fc组，小鼠肝脏组织结构完整、肝出血现象较少见。 3.sTNFRII-gAD通过中和血清TNFα使TNFα失去生物学效应 治疗后各组小鼠血清TNFα都保持在较高的水平，显著高于正常对照水平;但sTNFRII-gAD组或sTNFRII-Fc组血清TNFα却显著高于PBS组。尽管在造模后立即治疗模式下sTNFRII-gAD组与sTNFRII-Fc组之间TNFα水平无显著性差异(P2 h=1.000; P5 h=0.531);但造模后1h延迟治疗时，无论在治疗后2h还是5h，sTNFRII-gAD组TNFα水平显著高于sTNFRII-Fc组(P2 h=0.028; P5 h=0.029)。L929细胞毒性实验结果显示，当造模后立即治疗时，在治疗后2、5h，sTNFRII-gAD组TNFα活性均明显低于PBS组，三组间TNFα活性变化差异具有统计学意义(F=130.374，P＜0.001);在造模后延迟1h治疗时，在相同时间点(2、5h)三组细胞毒作用分别为97％、80.54％、80.62％和80.13％、74.35％、74.86％，三组间TNFα活性变化差异具有统计学意义(F=168.219，P＜0.001)，其中PBS组TNFα活性显著高于sTNFRII-gAD和sTNFRII-Fc治疗组(P＜0.001)。 4.sTNFRII-gAD明显抑制ALI过程中肝细胞凋亡 TUNEL结果显示，D-Gal/LPS诱发肝细胞发生了大面积凋亡，PBS组凋亡指数明显高于sTNFRII-gAD和sTNFRII-Fc组。免疫印迹分析显示，PBS组5h时肝脏中Caspase-3表达明显增强，并有其裂解片段的出现，表明Caspase-3被活化。此外，虽然造模后立即治疗时sTNFRII-gAD或sTNFRII-Fc治疗后Caspase-3表达无差异，但在造模后延迟1h治疗时sTNFRII-Fc组Caspase-3裂解片段表达显著增强，而sTNFRII-gAD组则几乎无表达。 结论： 无论是对ALI小鼠生存率的改善，还是肝功能和组织病理损伤的保护，sTNFRII-gAD融合蛋白较sTNFRII-Fc融合蛋白能更有效地预防和治疗D-Gal/LPS诱导的急性肝损伤。其主要机制在于，sTNFRII-gAD比sTNFRII-Fc能更有效地结合TNFα从而能更有效地抑制肝细胞的凋亡。