论文部分内容阅读
研究背景脂肪组织是人体中较为活跃的内分泌器官,由富含脂质的脂肪细胞、内皮细胞、周皮细胞、纤维母细胞、前体脂肪细胞、肥大细胞、免疫细胞以及上述各种细胞合成和转化形成的细胞外基质共同构成。正常状态下,脂肪组织内多种细胞分泌的抗炎因子和促炎因子处于平衡状态,共同维护脂肪组织微环境的稳定。但在肥胖、糖尿病等疾病状态下,脂肪组织会发生病理性扩张,脂质堆积,脂肪细胞肥大,造成毛细血管密度相对减少,脂肪细胞的供氧不足,引发脂肪组织促炎症因子分泌增多,抗炎因子分泌减少,造成脂肪组织功能紊乱。脂肪组织可以根据机体能量状况发生各种细胞形态、数目、大小、结构及相关功能等一系列动态变化称之为“脂肪组织重构”。病理性脂肪组织重构是引发多种代谢疾病及心血管疾病的危险因素,对人体健康造成极大的危害。活化素受体样激酶7(Activin receptor-like Kinase 7,ALK7)作为孤儿受体首次从大鼠的脑组织分离出来,是TGF-β超家族Ⅰ型受体之一,广泛表达于多种组织器官中。ALK7是位于细胞膜表面的跨膜蛋白,主要包括:N端配体结合区、跨膜区、C端丝氨酸/苏氨酸激酶区。当配体和ALK7受体结合形成配体-受体复合物时,可以通过激活下游信号分子Smad2/3并使其磷酸化,发挥多种生物学效应。研究表明,ALK7敲除的小鼠能够抵抗高脂饮食引起的肥胖并且能够减少脂质堆积。由此可知,ALK7可能与脂肪组织代谢活动密切相关。但是,ALK7是否对脂肪组织炎症具有调节作用,目前尚不清楚。基于以上研究,本课题将探讨ALK7是否能够通过Smad2/3通路调控高糖刺激下的脂肪细胞炎症反应。研究目的1.探讨高糖刺激对成熟脂肪细胞炎症的影响2.探讨高糖刺激对成熟脂肪细胞ALK7及Smad2/3磷酸化水平的影响3.探讨ALK7对高糖刺激下脂肪细胞炎症因子表达的影响材料方法本研究以正常人和糖尿患者内脏脂肪组织及3T3-L1小鼠前脂肪细胞系为研究对象,采用蛋白免疫印迹(Western blot)、实时定量逆转录聚合酶链反应(Real-time PCR)、免疫组化、免疫荧光、苏木素-伊红染色(HE染色)及细胞感染慢病毒等实验方法,分别观察:1.免疫荧光检测正常人和糖尿病患者内脏脂肪组织ALK7的分布及表达;2.Western blot检测正常人和糖尿患者内脏脂肪组织ALK7的表达;3.免疫组化法检测正常人和糖尿病患者内脏脂肪组织TNF-α、IL-6的表达;4.分化成熟的3T3-L1细胞在含25mM葡萄糖的DMEM中分别培养0小时、6小时、12小时、24小时、48小时,分别检测各个时间点ALK7的表达量;5.体外模拟糖尿病高糖状态,分为低糖组(5.5mM葡萄糖)、高渗组(5.5mM葡萄糖+19.5mM甘露醇)、高糖组(25mM葡萄糖)培养分化成熟3T3-L1前脂肪细胞24小时,Western blot检测ALK7蛋白表达水平及Smad2/3磷酸化水平的变化,RT-PCR法检测TNF-α、IL6的表达。6.慢病毒转染3T3-L1细胞,观察ALK7抑制后,Smad2/3磷酸化水平以及TNF-α、IL-6的表达水平。研究结果1.糖尿病患者内脏脂肪组织ALK7表达量增加2.糖尿病患者内脏脂肪组织炎症因子表达增加3.在高糖(25mM)刺激下,脂肪细胞ALK7表达量升高4.在高糖(25mM)刺激下,脂肪组织炎症因子表达量增加5.在高糖(25mM)刺激下,脂肪细胞Smad2/3磷酸化水平升高6.在高糖(25mM)刺激下,抑制脂肪细胞ALK7时,Smad2/3磷酸化水平及脂肪组织炎症因子表达量降低结论1.高糖上调成熟脂肪细胞ALK7的表达2.高糖刺激成熟脂肪细胞炎症因子TNF-α、IL-6的表达量升高3.ALK7通过Smad2/3通路调控高糖诱导成熟脂肪炎症因子的表达研究背景活化素受体样激酶7(Activin receptor-like kinase 7,ALK7)是具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞膜受体,作为TGF-β超家族Ⅰ型受体之一,它广泛参与机体代谢反应过程。脂肪组织是人体主要的能量代谢控制中心,它能够根据机体能量状态发生一系列动态变化,如组织结构和功能的变化,并将这种动态变化称为脂肪组织重构。当脂肪组织发生病理性重构时,脂肪组织功能发生紊乱,能量代谢障碍、炎症状态加重。这一系列变化将对机体健康造成损害。研究表明,ALK7在许多组织器官中都有表达,并且发现,ALK7在脂肪组织表达明显高于其他组织。ALK7不仅参与机体血糖的调节,还参与脂肪组织能量的代谢,提示ALK7可能在脂肪组织重构过程中发挥重要作用。随着生物学技术迅速发展,Cre-loxp系统已经广泛运用于体内外基因编辑,从而实现目的基因的敲除。Cre重组酶可以特异性识别floxp基因序列,从而将floxp标记的目的基因进行剪切,达到特定基因条件性敲除的目的。因此,我们利用Cre-loxp系统条件性基因敲除技术,构建脂肪组织ALK7特异性敲除小鼠,为进一步探讨ALK7在脂肪组织中的生物学作用提供动物模型。研究目的利用Cre-Loxp重组酶系统构建脂肪组织特异性敲除ALK7小鼠实验方法1.构建ALK7flox/flox基因型小鼠:将基因型为ALK7flox/-小鼠同系自交,通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测小鼠基因型,筛选出基因型为ALK7flox/flox纯合子小鼠。2.构建ALKflox/--Crep(+)基因型小鼠:将ALK7flox/flox基因型小鼠与Cre(+)基因型小鼠杂交,经基因型鉴定,筛选出ALK7flox/-:Cre(+)基因型小鼠3.构建ALK7flox/flox:Cre(+)基因型小鼠:将ALK7flox/-:Cre(+)基因型小鼠与ALK7flox/flox基因型小鼠杂交,经基因型鉴定,筛选出ALK7flox/flox:Cre(+)基因型小鼠,用于后续实验4.用Western blotting检测ALK7flox/flox与ALK7flox/flox:Cre(+)基因型小鼠白色脂肪和棕色脂肪ALK7表达量5.HE染色观察ALK7flox/flox与ALK7flox/flox:Cre(+)基因型小鼠内脏脂肪形态变化6.用免疫荧光法检测ALK7flox/flox与ALK7flox/flox:Cre(+)基因型小鼠ALK7分布及表达量实验结果1.成功构建脂肪组织ALK7特异性敲除小鼠2.脂肪组织特异性ALK7敲除小鼠脂肪组织中ALK7表达量显著降低3.HE染色观察脂肪组织ALK7特异性敲除小鼠和对照组小鼠脂肪组织形态无明显改变研究结论运用Cre-Loxp系统,成功构建出脂肪组织ALK7特异性敲除小鼠。与对照组小鼠相比,该系小鼠脂肪组织ALK7表达量显著降低(P<0.05),脂肪组织细胞形态无明显改变。