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研究背景： 肺癌是严重危害人类健康的第一大恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居全球恶性肿瘤的首位。肺腺癌是肺癌中最常见的病理类型，其发病人数呈逐年增多趋势。肺腺癌早期在CT上表现为肺结节，然而病灶早期较小且多位于两肺的外周，给临床医生判断其良、恶性带来极大挑战。因此，积极寻找新型的分子标志物，对肺腺癌的早期诊断具有十分重要的临床意义。环状RNA（CircRNA）具有组织特异性和疾病特异性，研究发现CircRNA在多种肿瘤中具有特定的表达谱，因此CircRNA具有成为肿瘤诊断标志物的潜力。 研究目的： 研究CircRNA作为分子标志物对肺腺癌的诊断价值，并研究其在增殖、凋亡及侵袭转移等方面对肺腺癌的影响，进一步研究其吸附的miRNA分子及可能的ceRNA机制，为肺腺癌的早期诊断提供新的思路。 研究方法： （1）筛查和验证 本研究首先应用CircRNA芯片对3例确诊肺腺癌的组织标本进行分析，在高表达的CircRNA分子中挑选出差异表达最明显的CircRNA（hsa_circ_0013958），使用qPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR）在多种肺腺癌细胞株、49例肺腺癌患者及30例肺腺癌患者血浆等标本中进行验证。 （2）hsa_circ_0013958诊断效能分析 采用ROC曲线分析hsa_circ_0013958作为诊断标志物在组织及血浆中的诊断价值。 （3）hsa_circ_0013958对肺腺癌增殖、凋亡、侵袭的影响 通过CCK-8实验和EDU实验检测hsa_circ_0013958对肺腺癌细胞增殖的影响，使用流式细胞仪检测hsa_circ_0013958对细胞凋亡的影响，Transwell实验检测hsa_circ_0013958对细胞迁移和侵袭的影响。裸鼠荷瘤实验从体内验证hsa_circ_0013958对肺腺癌的影响，对裸鼠的瘤组织进行免疫组化染色检测Ki67表达，并通过TUNEL法检测细胞凋亡比例。 （4）内源性竞争性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）机制研究 FISH(Fluorescence In Situ Hybridization)实验考察hsa_circ_0013958在肺腺癌细胞内的分布情况，通过生物信息学数据库分析hsa_circ_0013958可能的下游miRNA及mRNA分子，进一步通过荧光素酶报告法和Western Blot进行验证。 研究结果： （1）筛查和验证 CircRNA芯片共筛选出差异表达至2倍以上且有统计学差异的CircRNA分子59种，其中相对正常组织高表达的39种，低表达的20种。其中，hsa_circ_0013958（hsa_circRNA_100323）高表达最明显，因此选择它作为候选的CircRNA进行验证。Northern Blot和PCR产物测序验证qPCR正确后，检测了7种肺腺癌细胞株，发现hsa_circ_0013958相对于正常细胞，在肺腺癌细胞中hsa_circ_0013958明显升高（P＜0.05）。检测了49例肺腺癌患者的癌组织及癌旁组织中circ_0013958的表达情况，结果显示，肺腺癌中hsa_circ_0013958高表达（P＜0.05）。为了明确hsa_circ_0013958在血浆中是否高表达，检测30例患者血浆标本，结果显示，30例中有27例高表达。 （2）hsa_circ_0013958诊断效能分析 对组织标本结果进行ROC分析，结果显示hsa_circ_0013958的总体ROC曲线的曲线下面积（AUC）是0.815（P＜0.001），以0.00101为cutoff值，敏感度和特异度分别为0.755和0.796；Ⅰ期肺腺癌ROC的AUC是0.750（P＜0.001），敏感度和特异度分别为0.583和0.833；Ⅱ期肺腺癌ROC的AUC是0.766，敏感度和特异度分别为0.813和0.750；Ⅲ～Ⅳ期肺腺癌ROC的AUC为0.874，敏感度和特异度分别是0.762和0.857。血浆标本ROC曲线的AUC是0.794（P＜0.001），敏感度和特异度分别为0.667和0.933。 （3）hsa_circ_0013958对肺腺癌增殖、凋亡、侵袭的影响 hsa_circ_0013958对增殖的影响：CCK-8实验结果显示，肺腺癌细胞在敲低hsa_circ_0013958后细胞的OD450值较对照组明显下降（P＜0.01）。EDU实验显示在敲低hsa_circ_0013958后，处于增殖期的细胞比例明显减少（P＜0.01）。体内实验显示与对照组相比hsa_circ_0013958被敲低后能显著抑制肿瘤细胞的增殖（P＜0.001）。裸鼠肿瘤组织免疫组化结果显示，hsa_circ_0013958被敲低后组织的Ki67的表达量明显减少（P＜0.01）。 hsa_circ_0013958对凋亡的影响：流式细胞术结果显示，hsa_circ_0013958被敲低后细胞的凋亡比例明显增加（P＜0.01）。对裸鼠荷瘤实验中的瘤组织进行TUNEL实验，结果显示，hsa_circ_0013958被敲低后细胞凋亡的比例明显增加（P＜0.01）。 hsa_circ_0013958对侵袭的影响：Transwell实验显示hsa_circ_0013958被敲低后转移和侵袭的细胞数明显减少（P＜0.01）。 （4）ceRNA机制研究 在进行ceRNA机制研究之前，首先对hsa_circ_0013958进行细胞内定位分析。FISH结果显示它主要分布于胞浆中。生物信息学预测分析发现，有5个miRNA分子分别为miR-134、miR-545、miR-629、miR-509、miR-660，可能与hsa_circ_0013958结合。双荧光素酶报告法实验显示只有miR-134能够与hsa_circ_0013958分子结合，而在非小细胞肺癌中CCND1是miR-134下游的靶基因之一，据此推测可能存在circ_0013958/miR-134/CCND1通路。Western Blot实验证实了上述的推测。 研究结论： （1）通过CircRNA芯片筛选获得了在肺腺癌中差异表达的系列CircRNA分子，在肺腺癌细胞、组织及血浆等标本中使用qPCR方法验证了hsa_circ_0013958高表达；（2）体内及体外实验均表明，hsa_circ_0013958具有促进肺腺癌细胞增殖、转移和侵袭的作用；同时，hsa_circ_0013958也具有抑制细胞凋亡的作用；（3）hsa_circ_0013958通过miR-134影响CCND1蛋白而发挥促进细胞增殖等生物学功能；（4）hsa_circ_0013958具有成为肺腺癌早期诊断标志物的潜力。