研究背景心血管疾病是威胁人类健康的常见重大疾病之一，其病死率始终位于我国居民死因的首位，心血管疾病已成为我国的主要公共卫生问题。尽管现在的诊疗水平在不断提高，然而由于心血管疾病的病因繁多，病理机制复杂，其病死率、死亡率仍居高不下，提示在心血管疾病的发生发展过程中仍有未知因素参与。随着神经-内分泌-免疫网络学说的发展，免疫因素在心血管疾病中的作用日益受到众多学者的关注。1987年Wallukat等人首先在原发性扩张型心肌病患者血清中发现针对β₁-肾上腺素受体（β₁-adrenoceptor，β₁-AR）的自身抗体，即β₁-肾上腺素受体自身抗体（autoantibodies against β₁-adrenoceptor，β₁-AA）。随后，很多研究者又在恰加斯心脏病、原发性心电紊乱等多种心血管疾病患者血清中也检测到β₁-AA，并且其阳性率与滴度远远高于正常人群。随后的研究发现：β₁-AA可以与心肌细胞膜上的β₁-AR细胞外第二环（the second extracellular loop of β₁-adrenoceptor，β₁-AR-ECII，人鼠同源性为100％）结合，进而促进培养的乳鼠心肌细胞跳动频率增加、增强正常心房肌收缩、增加心肌细胞内的cAMP含量以及增加心肌细胞内Ca2+内流等，发挥着类似儿茶酚胺的作用。以上研究结果提示β₁-AA可能参与多种心血管疾病的病理生理过程。本课题组的前期研究结果发现：β₁-AA长期存在于大鼠体内时，在引起心脏结构改变、心功能降低的同时，还引起机体的抗体生成能力增加。抗体是由B淋巴细胞活化增殖、并经过一系列过程分化为浆细胞进而分泌的。有研究报道，外周血中B淋巴细胞数量的增加与心血管疾病的死亡率密切相关。因此，探讨β₁-AA是否对B淋巴细胞的增殖产生影响将为血清中β₁-AA阳性的心血管疾病患者的病理机制提供一定的理论依据。第一部分β₁-AA对大鼠B淋巴细胞增殖的影响目的探讨β₁-AA是否对培养的大鼠B淋巴细胞的增殖产生影响。方法1. β₁-AA阳性血清的制备用由吉尔生化上海有限公司合成的人β₁-AR-ECII（197～223，H-W-W-R-A-E-S-D-E-A-R-R-C-Y-N-D-P-K-C-C-D-F-V-T-N-R-A，人鼠同源性为100%，纯度大于95%）主动免疫大鼠获取β₁-AA阳性IgGs（positive IgGs, pIgGs），利用伪免疫组获取β₁-AA阴性IgGs（negative IgGs, nIgGs）作为对照。利用Mab Trap Kit试剂盒纯化血清中的总IgGs。纯化后的IgGs先经SDS-PAGE凝胶电泳检测其纯度，然后使用BCA蛋白定量试剂盒对总IgGs进行蛋白定量。2. B淋巴细胞的获得用Ficoll密度梯度离心法分离大鼠脾脏中的淋巴细胞并用免疫磁珠分选（MagneticActivated Cell Sorting，MACS）技术获得B淋巴细胞；用流式细胞术检测B淋巴细胞的阳性率与活力；用RPMI1640完全培养液将B淋巴细胞培养于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中。3. CCK8试剂盒检测β₁-AA对B淋巴细胞增殖的影响将pIgGs与nIgGs分别作用于静息B淋巴细胞和LPS刺激的B淋巴细胞，采用CCK8检测试剂盒检测β₁-AA对B淋巴细胞数量的影响。结果1.利用β₁-AR-ECII抗原肽段主动免疫大鼠获取β₁-AA1.1主动免疫模型建立成功β₁-AR-ECII抗原肽段初次免疫大鼠2周后，血清中β₁-AA的A值已由0.41±0.06升高到0.75±0.11（P=0.006，P<0.01）。并且，随着时间的延长，β₁-AA水平迅速升高并且8周时达高峰，A值达到3.01±0.020，且明显高于同期伪免疫组（A值为0.42±0.10，P=0.000，P <0.01）。以上结果提示：β₁-AR-ECII抗原肽段主动免疫大鼠模型建立成功，且免疫8周后进行大鼠腹主动脉采血并留取血清（图1）。1.2β₁-AA蛋白定性及定量测定用亲和柱试剂盒纯化血清中的总IgGs。用SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化的IgGs的纯度。结果显示，纯化的IgGs在SDS-PAGE凝胶电泳后出现两条带，一条表示IgG重链（55KD），另一条表示轻链（25KD），这两条带与IgG标准品相一致（图2），提示纯化效果理想。利用BCA蛋白定量试剂盒测定纯化的IgGs浓度（图3及表1）。2.成功分离大鼠B淋巴细胞2.1MACS后大鼠B淋巴细胞的阳性率用Ficoll密度梯度离心法分离大鼠脾脏淋巴细胞经MACS分选后，流式细胞术检测B淋巴细胞的阳性率为92.7%（图4）。该结果提示大鼠B淋巴细胞分选成功。2.2MACS后大鼠B淋巴细胞的活性测定流式细胞术检测经MACS分选后大鼠B淋巴细胞的活细胞率为94.6%（图5）。3. β₁-AA对静息的B淋巴细胞的数量无影响0.1M pIgGs作用静息大鼠B淋巴细胞24小时后， A值变化无统计学差异（A值：0.320±0.012vs.0.309±0.011, t=0.060, P=0.524, P>0.05,图6）。该结果提示β₁-AA可能对静息B淋巴细胞的数量无改变。4. β₁-AA促进LPS激活的B淋巴细胞增殖0.1M pIgGs促进了LPS刺激的大鼠B淋巴细胞增殖（A值：0.739±0.036vs.0.533±0.032, P<0.05），0.1M β₁-AA阴性的IgGs（β₁-AA negative IgGs, nIgGs）却无此作用（A值：0.552±0.044vs.0.533±0.032, P=0.350, P>0.05,图7）。当用β₁-AR-ECII将β₁-AA中和以后，与nIgGs相比，β₁-AA的促增殖效应消失（A值：0.552±0.044vs.0.560±0.048, P=0.238, P>0.05,图7）；β₁-AR-ECII本身对活化B淋巴细胞的增殖无影响（A值：0.575±0.052vs.0.533±0.032, P=0.078, P>0.05,图7）。以上结果提示，促进LPS激活的B淋巴细胞增殖是由β₁-AA引起的。5. β₁-AA对LPS刺激的B淋巴细胞的增殖作用具有浓度依赖趋势不同浓度β₁-AA（0.001M,0.01M,0.1M,1MpIgGs）干预LPS预刺激48小时的B淋巴细胞24小时后，与nIgGs组相比，A值分别由0.536±0.040、0.542±0.036、0.538±0.030、0.561±0.051增加到0.612±0.029、0.654±0.047、0.739±0.036、0.768±0.030，提示β₁-AA对LPS刺激的大鼠B淋巴细胞的促增殖作用有浓度依赖的趋势（图8）。小结β₁-AA可以促进LPS激活的大鼠B淋巴细胞增殖，并且该增殖效应具有浓度依赖的趋势；β₁-AA对静息B淋巴细胞的数量无改变。第二部分β₁-AA致B淋巴细胞增殖的可能机制目的探讨β₁-AA致培养的大鼠B淋巴细胞增殖的可能机制。方法1. B淋巴细胞和CD4⁺T淋巴细胞的获得用Ficoll密度梯度离心法分离大鼠脾脏中的淋巴细胞并用免疫磁珠分选（MACS）技术获得B淋巴细胞和CD4⁺T淋巴细胞；流式细胞术检测MACS分选获得的这两种细胞的阳性率；利用Guava流式仪检测细胞的活力；培养方法同第一部分。2. B淋巴细胞中β₁-AR的检测用Real Time PCR技术检测B淋巴细胞中是否有β₁-AR的基因表达；用免疫荧光方法检测B淋巴细胞膜表面是否有β₁-AR的蛋白表达。3. CCK8试剂盒检测B淋巴细胞增殖能力β₁-AR阻断剂Metoprolol、β₂-AR阻断剂ICI118551、β₁/β₂-AR阻断剂Nadolol预孵育后利用CCK8法探讨β₁-AA致B淋巴细胞增殖是否通过β-AR受体途径起作用；β₁-AA作用72小时的、ConA刺激的CD4⁺T淋巴细胞的培养上清液作用于静息B淋巴细胞24小时后，利用CCK8法探讨β₁-AA是否通过作用于CD4⁺T淋巴细胞间接影响B淋巴细胞的数量。结果1. B淋巴细胞膜表面存在β₁-AR1.1B淋巴细胞中有β₁-AR的基因表达利用公司合成的β₁-AR、β₂-AR通过Real Time-PCR检测到B淋巴细胞中有β₁-AR与β₂-AR基因表达（图9）。1.2B淋巴细胞膜表面有β₁-AR的蛋白表达利用免疫荧光法检测到B淋巴细胞膜表面存在β₁-AR的蛋白表达（图10）。2. β₁/β₂-AR共同参与介导β₁-AA致激活B淋巴细胞增殖作用2.1β₁-AR参与介导β₁-AA致激活B淋巴细胞增殖作用0.01M β₁-肾上腺素受体（β₁-AR）阻断剂Metoprolol预作用，可以部分阻断pIgGs的致激活B淋巴细胞的增殖作用（0.739±0.036vs.0.672±0.028, P=0.008, P<0.01,图11），但仍高于PBS溶剂对照组的0.533±0.032（P=0.000, P<0.01,图11）；，Metoprolol本身无作用（0.533±0.032vs.0.523±0.036, P=0.695，P>0.05，图12）。该结果提示：β₁-AA可能部分通过B淋巴细胞膜表面的β₁-AR引起活化的B淋巴细胞增殖。2.2β₂-AR参与介导β₁-AA致激活B淋巴细胞增殖作用0.01M β₂-肾上腺素受体（β₂-AR）阻断剂ICI118551的预作用，使得A值由原来的0.739±0.036降低至0.638±0.03（3P<0.01），但仍高于PBS溶剂对照组的0.533±0.03（2P=0.000,P<0.01）；ICI118551本身无作用（0.533±0.032vs.0.511±0.031, P=0.390, P>0.05,图12）。该结果提示：β₁-AA可能部分通过B淋巴细胞膜表面的β₂-AR引起活化的B淋巴细胞增殖。2.3β₁/β₂-AR共同介导β₁-AA的致激活B淋巴细胞增殖作用β₁/β₂-AR两种受体的非特异性阻断剂Nadolol的预作用使β₁-AA对活化B淋巴细胞的增殖效应消失（A值：0.528±0.062vs.0.533±0.032, P>0.05）；Nadolol本身无作用（0.533±0.032vs.0.528±0.061, P=0.855, P>0.05,图12）。该结果提示：β₁-AA对LPS刺激的B淋巴细胞的促增殖作用可能是通过β₁-AR和β₂-AR信号通路共同介导的。3. β₁-AA可能通过激活的CD4⁺T淋巴细胞间接促进静息B淋巴细胞增殖3.1大鼠CD4⁺T淋巴细胞的获得及活性测定用密度梯度离心法分离大鼠脾脏淋巴细胞经免疫磁珠分选后，CD4⁺T淋巴细胞阳性率为92.7%（图13）。流式细胞术检测分选后的大鼠CD4⁺T淋巴细胞的活细胞率>90%。3.2β₁-AA激活的CD4⁺T淋巴细胞培养上清液促进了静息B淋巴细胞增殖PBS、0.1M pIgGs、0.1M nIgGs分别作用于刀豆蛋白A（ConA）刺激的CD4⁺T淋巴细胞，72小时后取出三种培养上清液，并分别作用于静息B淋巴细胞24小时后，使得反应增殖效应的A值分别为0.460±0.033、0.480±0.054、0.552±0.055（F=6.061，P=0.012，P<0.05）。与PBS组相比，阴性IgGs组没有促进静息B淋巴细胞的增殖效应（0.480±0.054vs.0.460±0.033, P=0.483, P>0.05）。与nIgGs组相比，pIgGs组促进了静息B淋巴细胞的增殖作用（0.55±0.055vs.0.480±0.054, P=0.02, P<0.05）（图14）。该结果提示，β₁-AA可以通过作用于CD4⁺T淋巴细胞间接引起静息B淋巴细胞增殖。小结β₁-AA可能通过B淋巴细胞表面的β₁/β₂-AR引起B淋巴细胞增殖；也可能通过作用于CD4⁺T淋巴细胞间接导致静息B淋巴细胞增殖。结论β₁-AA既可能通过B淋巴细胞表面的β₁-AR/β₂-AR致活化B淋巴细胞增殖，也可能通过作用于活化的CD4⁺T淋巴细胞间接导致静息B淋巴细胞增殖。