麻醉对婴幼儿脑发育的安全性越来越得到关注。氯胺酮是小儿麻醉的常用药物，然而大量动物实验证实反复接受氯胺酮麻醉将加重未成熟脑的神经元凋亡并导致动物成年后认知能力受损。因此，研究氯胺酮对婴幼儿脑发育的影响及其损伤机制对麻醉实施中婴幼儿脑发育的安全性具有重要意义。　　人类妊娠中期至出生后2-3年内（啮齿类动物出生后几周内）是神经系统的快速发育期，称为脑生长爆发期(BGS)，在此期间神经细胞发育活跃，未成熟神经系统对神经毒性因子特别敏感。氯胺酮为NMDA受体阻断剂，目前动物实验研究发现，反复接受麻醉剂量氯胺酮可持续阻断未成熟神经细胞NMDA受体并使细胞内钙离子浓度暂时降低，而当氯胺酮作用消退后，NMDA受体会代偿性过度上调并结合更多的内源性谷氨酸导致钙离子内流增加，使细胞内钙离子([Ca2+]i)负荷超出了线粒体的缓冲能力，造成线粒体产生和释放过多活性氧(ROS)，最终导致细胞凋亡。然而氯胺酮诱导细胞内ROS水平增高的下游致凋亡信号转导机制尚不明确。　　低氧诱导因子-1α(HIF-1α)通常被认为是调控细胞在缺氧条件下适应低氧环境以及存活的重要转录因子。然而近期研究发现，HIF-1α的表达也可通过调控p53和BNIP3表达起到促细胞凋亡作用，且常氧下细胞内ROS水平增高可激活HIF-1α高表达。我们推测，未成熟脑在反复接受氯胺酮麻醉后，细胞内游离钙离子浓度失衡，导致ROS增高并诱导HIF-1α高表达，进一步激活下游促凋亡基因p53和BNIP3的表达，从而加强了神经细胞的凋亡，造成成年后认知能力受损。　　我们通过本次研究，首先从临床上观察短期内多次接受氯胺酮麻醉对婴幼儿脑发育的影响，继之从动物体外细胞和在体实验研究HIF-1α在多次接受氯胺酮麻醉致发育期海马神经元凋亡中的作用和信号转导机制，以期为回答氯胺酮麻醉对婴幼儿脑发育的影响以及为术后认知功能障碍防治提供新的思路。实验分为以下四部分:　　第一部分多次接受氯胺酮麻醉对婴幼儿脑发育影响的初步研究　　目的:观察短期内多次接受氯胺酮麻醉对婴幼儿神经系统发育的影响。　　方法:选择半年内年龄小于22个月，接受氯胺酮麻醉的面部肿物激光手术治疗的门诊患儿。根据接受手术麻醉次数分为接受单次氯胺酮麻醉组(Ket1，n=20)、2次麻醉组(Ket2，n=16)和3次麻醉组(Ket3，n=13)。比较患儿治疗前和治疗结束后24h时的血浆NSE、S-100β水平以及治疗前和治疗结束后第3天的第二版Bayley婴幼儿发展量表(BSID-Ⅱ)评分。结果:各组治疗结束后血浆NSE和S-100β值均较治疗前升高（P＜0.05）。Ket3组治疗结束后BSID-Ⅱ得分较治疗前降低(P＜0.05)，而Ket1和Ket2组治疗结束后BSID-Ⅱ得分与治疗前均无显著统计学差异（P＞0.05）。结论:短期内多次接受（＞2次）氯胺酮麻醉可能对婴幼儿中枢神经系统发育存有潜在的负面影响，但其远期效应仍不明确。　　第二部分大鼠原代海马神经元培养与鉴定　　目的:在体外培养大鼠原代海马神经元并鉴定神经元纯度，为进一步研究氯胺酮致海马神经元凋亡作用的机制奠定基础。　　方法:取胎龄18天SD大鼠胎鼠的海马组织进行体外细胞培养。在显微镜下进行形态学鉴定，并在培养第5天通过免疫荧光细胞化学法(NSE抗体和DAPI双荧光染色)鉴定培养的神经元纯度。　　结果:经体外培养得到的大鼠原代海马神经元纯度为91.2±1.8％。　　结论:通过该部分实验成功进行了大鼠原代海马神经元的体外培养，得到了较高纯度的海马神经元，可用于后续实验。　　第三部分 HIF-1α在氯胺酮致发育期海马神经元凋亡中的作用及信号转导机制研究　　目的:通过动物体外细胞培养研究HIF-1α在反复接受氯胺酮处理致发育期海马神经元凋亡中的作用及信号转导机制。　　方法:体外培养第5天大鼠未成熟海马神经元，随机分为6组:空白对照组(Control组)、溶剂组（Vehicle组）、氯胺酮+HIF-1α抑制剂YC-1组（Ketamine+YC-1组）、氯胺酮+抗氧化剂L-carnitine组（Ketamine+L-carnitine组）和氯胺酮+钙通道阻断剂nimodipine组（Ketamine+nimodipine组），氯胺酮处理浓度为10μM，处理时间为3h，并连续处理3天。最后一次处理后24h各组采用TUNEL方法检测各组海马神经元凋亡率(n=6)，应用荧光探针检测各组细胞内[Ca2+]i和ROS水平(n=6)，通过western blot方法检测各组HIF-1α及凋亡相关蛋白(p53、BNIP3、Bcl-2/Bax、cleaved caspase-3)的表达水平(n=6)，并通过real-time PCR技术检测各组HIF-1αmRNA转录水平(n=6)。　　结果:最后一次氯胺酮处理后24h，Ketamine组细胞凋亡率和HIF-1α、p53、BNIP3、cleaved caspase-3蛋白表达水平显著高于其他各组，而Bcl-2/Bax比值低于其他各组(P＜0.05);Ketamine组、Ketamine+YC-1组和Ketamine+L-carnitine组细胞内[Ca2+]i显著高于其它3组(P＜0.05); Ketamine组和Ketamine+YC-1组细胞内ROS水平及HIF-1α mRNA转录水平均高于其他各组（P＜0.05）。　　结论:HIF-1α在氯胺酮致发育期海马神经元凋亡中起重要介导作用，HIF-1α通过[Ca2+]i/ROS/HIF-1α信号通路介导其下游p53和BNIP3蛋白的表达以及后续的Bcl-2/Bax蛋白比例失衡，并通过caspase-3途径执行细胞凋亡效应。此外，增加HIF-1α mRNA转录是ROS上调HIF-1α表达量的重要机制。　　第四部分 HIF-1α在氯胺酮麻醉致大鼠脑生长爆发期海马神经元凋亡中的作用及信号转导机制研究　　目的:通过动物在体实验验证HIF-1α在多次接受氯胺酮麻醉致脑生长爆发期大鼠海马神经元凋亡中的作用及信号转导机制。　　方法:出生7天幼鼠随机分为6组:生理盐水对照组（Saline组）、溶剂组(Vehicle组)、氯胺酮麻醉组（Ketamine组）、氯胺酮麻醉+HIF-1α抑制剂YC-1组（Ketamine+YC-1组）、氯胺酮麻醉+抗氧化剂L-carnitine组(Ketamine+L-carnitine组)和氯胺酮+钙通道阻断剂nimodipine组（Ketamine+nimodipine组），氯胺酮麻醉剂量为75mg/kg腹腔内注射，每天1次，连续3天。最后一次麻醉后24h，采用TUNEL法检测各组海马CA1和DG区神经元凋亡水平(n=6);取幼鼠海马组织，应用荧光探针检测各组细胞内[Ca2+]i和ROS水平(n=6)，通过western blot方法检测各组HIF-1α蛋白及凋亡相关蛋白(p53、BNIP3、Bcl-2/Bax、cleaved caspase-3)的表达水平(n=6)，并通过real-time PCR技术检测各组HIF-1αmRNA转录水平(n=6)。待大鼠成年后，通过Morris水迷宫和被动躲避实验检测并比较各组大鼠学习记忆能力(n=12)。　　结果:最后一次氯胺酮麻醉后24h，Ketamine组海马CA1和DG区神经元细胞凋亡水平显著高于其他各组(P＜0.05); Ketamine组海马组织HIF-1α、p53、BNIP3、cleaved caspase-3蛋白表达水平也显著高于其他各组，而Bcl-2/Bax比值低于其他各组(P＜0.05); Ketamine组、Ketamine+YC-1组和Ketamine+L-carnitine组细胞内[Ca2+]i显著高于其它3组(P＜0.05); Ketamine组和Ketamine+YC-1组细胞内ROS水平及HIF-1αmRNA转录水平均高于其他各组（P＜0.05）。Ketamine组大鼠成年后在Morris水迷宫定位航行实验第4和5天找到平台时间和游泳里程均高于其它各组(P＜0.05)，Morris水迷宫空间探索实验中Ketamine组大鼠穿越原平台位置次数以及在原平台200％辐散面积范围内活动的时间比例显著低于其它各组（P＜0.05）;被动躲避实验中，Ketamine组大鼠从明箱进入暗箱时间显著少于其它各组(P＜0.05)。　　结论:该部分实验从动物整体水平验证了HIF-1α在氯胺酮麻醉致脑生长爆发期海马神经元凋亡中的重要介导作用，并验证了HIF-1α通过[Ca2+]i/RO S/HIF-1α信号通路介导其下游p53和BNIP3蛋白的表达以及后续的Bcl-2/Bax蛋白比例失衡，经由caspase-3途径执行细胞凋亡效应，最终对动物成年后学习记忆等认知功能产生负面影响。同时在体内验证了增加HIF-1αmRNA转录是ROS上调HIF-1α表达量的重要机制。