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心脏是胚胎发育过程中最早形成的器官,其间涉及许多相关基因依时空顺序差次表达以及多条信号通路(如Notch信号通路、BMP信号通路、Wnt信号通路等)的精确调控,以保证心肌细胞的正确迁移、增殖以及分化。其中,任意基因的异常都有可能导致先天性心脏病的发生。先天性心脏病是新生儿期最常见的先天畸形之一,发病率高达0.8%~1%,是导致人类孕期流产、死胎和新生儿发育缺陷甚至死亡的主要原因之一,严重危害着人类的健康和生存质量,给家庭和社会带来巨大的负担。因此,从基因和分子水平探索胚胎心脏形成及发育机制成为防治先天性心脏病基础研究新方向之一。MicroRNA(mi RNA)是一类长约22 nt的非编码小RNA,通过与靶基因mRNA的3’UTR区域结合,介导mRNA降解或抑制其转录后水平的表达,导致靶标蛋白表达降低,从而参与并调控时序发育、细胞凋亡、细胞分化、激素分泌等生理过程及多种疾病发生过程,其表达水平的变化与疾病的发生密切相关。研究发现miRNAs无论是在细胞增殖、分化,还是在生物发育及疾病发生发展过程中均发挥重要作用,因而引起了研究人员越来越多的关注。有关研究表明,miRNA不仅参与了心脏发育与心肌重构,并且在心脏疾病的发生发展中起着一定作用。本研究小组前期通过生物芯片技术筛选发现,miR-375基因在室间隔缺损胚胎心肌组织中的表达丰度显著高于正常人工流产胚胎心肌组织,随后我们采用实时荧光定量PCR验证了这一结果;另外我们还发现miR-375在先天性心脏病胎儿的孕母(妊娠18-22周)血液中也呈现高表达,提示miR-375很有可能在胚胎心脏发育过程中发挥着重要作用。但miR-375致胚胎心脏发育畸形的功能与机制研究目前并无文献报道。鉴于P19细胞和斑马鱼是心脏发育分子机制研究的经典模型,本研究借助上述模型,通过改变miR-375表达水平,探讨了miR-375过表达对P19细胞增殖、凋亡、分化的影响,评价了其在斑马鱼胚胎心脏发育中的功能,并初步分析了miR-375下游作用的靶标,为先天性心脏病发病机制的基础研究提供新线索。第一部分mir-375过表达对p19细胞增殖、凋亡的影响目的:构建mir-375过表达质粒,筛选出稳定过表达mir-375的p19细胞株,研究mir-375对p19细胞增殖、凋亡的影响;获得mir-375过表达影响斑马鱼胚胎心脏发育的表型。方法:构建mir-375过表达质粒,与gfp(greenfluorescentprotein,绿色荧光蛋白)对照载体分别转染p19细胞,嘌呤霉素筛选两周,荧光观察和qrt-pcr验证筛选出稳定表达mir-375的细胞株。cck-8检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期;并用hoechst染色、流式细胞计数分析、实时荧光定量pcr等技术,检测bax/bcl-2表达水平;westemblot法检测凋亡过程中蛋白水平的变化,以评价mir-375对p19细胞凋亡的影响;斑马鱼单细胞期显微注射mir-375minics观察mir-375对胚胎心脏形态学的影响。结果:mir-375过表达抑制了p19细胞的增殖;抑制p19细胞进入s期,凋亡相关的bax/bcl-2比值增高,细胞凋亡增加;mir-375过表达可致斑马鱼胚胎发育出现心包水肿等心脏畸形表型。结论:mir-375过表达能够影响p19细胞的增殖与凋亡功能,并致斑马鱼胚胎发育出现心包水肿等心脏畸形表型。第二部分miR-375过表达对P19细胞分化和Notch信号通路的影响目的:研究mi R-375过表达对P19细胞分化、Notch信号通路的影响。方法:诱导稳定过表达miR-375的P19细胞向心肌细胞分化,实时荧光定量PCR检测心肌细胞分化过程中心肌特异性标记物GATA4、cTnT、Mef2c的变化以及Notch信号通路相关因子在分化过程中的表达变化,Westem blot法检测分化过程中相关蛋白表达的变化。荧光素酶验证Notch2是否是miR-375的下游靶标。结果:miR-375过表达可抑制P19细胞向心肌细胞的分化,心肌标记物的表达量在细胞分化过程中逐渐升高,但就某一分化点而言,心肌标记物表达量在miR-375过表达组中较对照组低;Notch2是miR-375的下游靶标,miR-375过表达可能通过抑制Notch信号通路进而影响P19细胞的分化。结论:mi R-375过表达可能通过影响Notch信号通路,影响P19细胞向心肌细胞的分化。