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目的:以Tel3c/4c嗜热Ⅱ型内含子为基础,筛选并突变影响嗜热Ⅱ型内含子编码蛋白反转录结构域的关键氨基酸位点,构建反转录功能失活的新型Thermo-InGE嗜热型基因编辑系统,并以大肠杆菌和嗜热栖热菌HB27作为宿主验证Thermo-InGE基因编辑系统的特性与功能。方法:1.大肠杆菌中构建嗜热型Thermotargetron打靶载体及其打靶效率检测:以短暂耐高温的模式菌株——大肠杆菌为基础,随机选择lacZ基因上20个靶点为研究对象,构建基于IPTG诱导的大肠杆菌Thermortargetron基因打靶系统,并选择其中lacZ60a、lacZ369a和lacZ515a这3个打靶位点为代表分析温度（25℃、37℃、42℃、45℃、48℃、50℃）、IPTG浓度（0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L）及诱导时间（0h、1 h、2h、3h、4h、5h、6h、7 h）对打靶效率的影响。2.基于嗜热Ⅱ型内含子Tel3c/4c-RT构建嗜热型基因组编辑系统——Thermo-InGE系统:利用生物信息学技术分析并筛选可能影响Tel3c/4c反转录结构域（Tel3c/4c-RT）的关键氨基酸位点;并对筛选到的关键氨基酸位点进行定点突变,以Thermotargetron系统为基础,构建Tel3c/4c-RT突变的突变型Thermotargetron打靶系统;然后,以大肠杆菌lacZ基因为靶点,通过蓝白斑计数分析突变型Thermotargeron系统的打靶效率,筛选出影响Tel3c/4c-RT反转录功能最核心的催化位点;最后,基于反转录功能失活的Tel3c/4c-RT构建嗜热型基因组编辑系统——Thermo-InGE系统。3.Thermo-InGE基因编辑系统的功能分析及验证:以大肠杆菌lacZ基因为例,设计两种基因编辑条件验证Thermo-InGE系统的基因编辑效果。（1）该系统在没有同源臂存在时的基因编辑效果,即利用细胞非同源末端随机链接（Non-homologous end j oining,NHEJ）进行基因编辑的效果;（2）该系统在有同源臂存在条件下的基因编辑效果,即构建靶点删除8.0 bp和1.0 kb的同源序列验证基因敲除效果。4.Thermus thermophilus HB27中构建Thermotargetron打靶载体及打靶功能探究:以嗜热栖热菌HB27（Thermus thermophilus HB27）为宿主,选择该菌株与黄色色素合成相关的litR和ctrB作为靶基因,构建基于groEl启动子和slpA启动子的Thermotagetron系统,并验证该系统在不同温度（50℃、55℃、60℃、65℃、70℃）下的基因打靶功能。结果:1.大肠杆菌中构建嗜热型Thermotargetron打靶载体及其打靶效率检测:（1）IPTG诱导型Thermortargetron基因打靶系统构建及打靶功能分析:根据算法预测出20个lacZ基因上符合识别规律的打靶位点,菌落PCR及测序结果显示:20个lacZ基因位点Thermortargetron打靶载体构建成功,载体打靶功能验证结果显示9个位点打靶成功、11个位点打靶失败。（2）温度对Theromotargetron打靶活性的影响:25℃诱导时,在lacZ369a、lacZ60a和lacZ515a打靶效率均为0;37℃诱导时,在lacZ369a、lacZ60a和lacZ515a靶位点的打靶效率分别为（2.31±4.6）%、（0.64±1.2）%和0;42℃诱导时,在lacZ515a靶点的打靶效率为（0.50±0.87）%,其余两个位点的打靶效率为0,50℃高温诱导时,在lacZ369a、lacZ60a、lacZ515a靶点的打靶效率分别为:（99.42±0.61）%、（96.00±0.76）%和（61.00±5.70）%。（3）IPTG诱导浓度和诱导时间对Thermotargetron打靶效率的影响:在未加IPTG诱导时,lacZ369a、lacZ60a和lacZ515a的打靶效率均为0,用终浓度1.0 mmol/L IPTG诱导5小时后在lacZ369a、lacZ60a和lacZ515a的打靶效率分别达到（98.05±1.67）%、（91.76±7.08）%和（69.77±5.86）%,3个位点平均打靶效率为（86.5±12.1）%。（4）短暂高温（48℃）对大肠杆菌lacZ基因的影响:大肠杆菌BL21（DE3）经2种温度诱导后在平板上均未获得白色菌落,且随机挑选蓝色单克隆进行菌落PCR,其结果显示全为野生型条带。2.基于嗜热Ⅱ型内含子Tel3c/4c构建嗜热型基因组编辑系统——Thermo-InGE:（1）Tel3c/4c-RT结构域同源序列比对及关键氨基酸活性位点筛选:通过生物信息学筛选获得D194、1195、S196、G197、C198、F199、Q241、G242、R274、Y275、A276、D277、D278、L324、G325等 15个可能影响Tel3c/4c-RT反转录活性的氨基酸位点。（2）Tel3c/4c-RT定点突变及突变型Thermotargetron载体构建:菌落PCR及测序结果显示:D194、1195、S196、G197、C198、F199、Q241、G242、R274、Y275、A276、D277、D278、L324、G325等 15个单突变体及D277D278双突变体构建成功;以lacZ60a、lacZ369a、lacZ2586a这3个位点作为靶点成功构建48个Tel3c/4c-RT突变载体。（3）Tel3c/4c-RT关键活性位点突变对嗜热Ⅱ型内含子“归巢”效率的影响:Tel3c/4c-RT突变后,其“归巢”效率均有不同程度降低,其中,F199、G242、R274、D277、D278、D277D278突变后,Thermotargetron的归巢功能几乎完全丧失;其中,F199、D277、D278、D277D278突变后宿主细胞存在死亡现象,且D277（Mg2+结合位点）突变体转化的菌株经诱导后在lacZ2586a位点存在极低效率的移码突变;（4）基于Mg2+结合位点突变体（D277A、D278A、D277AD278A）构建Thermo-InGE系统。3.Thermo-InGE基因编辑系统的功能分析及验证:（1）Thermo-InGE载体中非同源重组系统的构建及效率验证:菌落PCR及测序分析表明在pACD-277-lacZ-60a等9个质粒载体中成功重组NHEJ系统;Thermo-InGE重组NHEJ系统后在靶点及靶点1.0 kb范围内未发现lacZ基因序列有移码、缺失或点突变的改变,但平板筛选结果显示载体转化后,在平板上获得的菌落数量有明显增多的趋势。（2）Thermo-InGE系统中构建靶点同源序列及其基因敲除效率验证:菌落PCR及测序分析表明lacZ60a和lacZ369a靶点删除8.0 bp和删除1.0 kb的同源序列载体构建成功;基因敲除效果分析显示无论是lacZ369a位点还是lacZ60a位点的同源序列载体转化BL21（DE3）后在平板上均难以获得菌落、且都是蓝斑,菌落PCR验证结果显也表明蓝斑均为野生型。4.Thermus thermophilus HB27中构建Thermotargetron打靶载体及打靶功能探究:（1）嗜热型Thermotargetron打靶载体构建:菌落PCR及测序分析表明pHH-litR1a等7个质粒载体构建成功。（2）嗜热型Thermotargetron打靶载体功能验证:结果表明在本研究设置的温度诱导条件下嗜热型Thermotargetron载体在litR1a、litR1 39s、litR1 87a、litR391s、ctrB94a、ctrB301a和ctrB718a位点均无打靶功能。（3）构建slpA启动的嗜热型Thermotargetron打靶载体及其打靶功能验证:嗜热型Thermotargetron更换slpA启动子后,在litR1a、litR187a、litR391s和ctrB94a位点依然无打靶功能。结论:1.在大肠杆菌中成功构建高效嗜热基因打靶系统Thermotargetron,为嗜热Ⅱ型内含子的快速功能分析提供了良好的检测平台,可为短暂耐高温微生物的遗传改造提供新的遗传改造工具。2.筛选到影响Tel3c/4c-RT反转录活性的最关键的催化位点,突变关键催化位点可失活反转录活性,阻止嗜热Ⅱ型内含子的“归巢”,且基于Mg2+结合位点突变体成功构建出具有基因编辑潜力的Thermo-InGE系统。3.Thermo-InGE系统可在打靶位点引入双链DNA的损伤,且这种损伤不能被细胞的同源重组方式修复,但在有NHEJ系统辅助时,该损伤或许能够被细胞以“无痕”修复的方式进行修复,但其中具体的修复机制还需进一步地分析阐明。4.在目前的条件下,本研究构建的嗜热型Thermotargetron 打靶系统在Thermus thermophilus HB27 中尚不具备打靶功能,推测 Thermus thermophilus HB27中的某些细胞成分或其他未知因素可能影响了 Thermotargetron的结构和功能,从而导致该系统无法发挥基因打靶活性,具体原因还需进一步探究。