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CRISPR-on是以一种RNA为引导，进而转录激动多种内源性基因表达的系统。在CRISPR-Cas9改造的体系中，它的两个催化活性位点RuvC和HNH被失活，转录激活域VP64、HSF1及p65偶联Cas9蛋白。 CRISPR只需两种元件Cas9蛋白和sgRNA共同作用。本研究中，我们不对dCas9（Cas9核酸酶失活）以及转录激活因子做任何变动，而是通过简单克隆方法，将sgRNA插入到四环素调控载体中。在CRISPR-on激活基因表达的基础上，我们又通过药物调控四环素体系，诱导sgRNA表达的开放或关闭，达到双重调控的目的。首先，我们设计sgRNA骨架结构，组装到四环素调控质粒（pLVCT-rtTR-KRAB-2 SM2& pLVCT-tTR-KRAB），其中与目的基因互补配对的20 bp序列可以任意替换。因慢病毒能够将转座子信息整合到宿主基因组中，并使之长期稳定存在。我们需要将四环素调控的sgRNA、Cas9及转录激活因子元件包装成慢病毒，并用这3种慢病毒同时感染A549细胞。为了简化后续的操作流程，我们使用嘌呤霉素和G418（新霉素）筛选出包含Cas9蛋白和转录激活因子的A549稳转细胞系。后续步骤需将sgRNA的慢病毒感染稳转细胞系。转录起始位点(TSS)上游-200 bp至+1 bp是sgRNA的靶向区域，基于此原则我们设计人源生长激素(GH) sgRNAs、胰岛素(INS)和解偶联蛋白(UCP1)并构建了相应四环素载体。在Doxycycline诱导条件下，通过Q-PCR(定量PCR)等实验验证CRISPR-on确实能够上调部分基因表达。 我们将转导Cas9蛋白和转录激活因子的细胞筛选成稳转细胞系，提高基因转录激活表达效果，并且减少实验周期。同时，四环素调控系统具有低本底泄露、灵敏度高可控性好等特点。基于上述的工作，我们可以通过药物加减，达到实时有效控制基因表达的目的。