【摘 要】
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草鱼（Ctenopharyngodon Idella）是我国淡水养殖的主要品种之一,具有重要的经济价值。但是由草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus,GCRV）引起的草鱼出血病死亡率很高,给草鱼养殖业造成巨大的损失。流行病学研究表明,现今,II型GCRV是流行最严重的主要病毒,所以急需开发一种有效并实用的GCRV II疫苗,而现今的疫苗大多是注射免疫,存在着实际操作困难,成本高的问
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草鱼（Ctenopharyngodon Idella）是我国淡水养殖的主要品种之一,具有重要的经济价值。但是由草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus,GCRV）引起的草鱼出血病死亡率很高,给草鱼养殖业造成巨大的损失。流行病学研究表明,现今,II型GCRV是流行最严重的主要病毒,所以急需开发一种有效并实用的GCRV II疫苗,而现今的疫苗大多是注射免疫,存在着实际操作困难,成本高的问题,而口服疫苗的开发是解决上述问题一个很好的策略。本研究以Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP56为研究对象,制备了口服枯草芽孢杆菌亚单位疫苗,并通过口服免疫方式对疫苗的免疫保护效果进行评价。本研究工作分为VP56蛋白潜在抗原表位的筛选、枯草芽孢杆菌可口服疫苗的制备和活体检测三个部分。1.VP56蛋白潜在抗原表位的筛选我们运用DNASTAR软件分析了VP56蛋白的抗原表位,将其分为4个片段,分别扩增出包括VP56全长和4个片段在内的5个基因序列,并将这5个基因序列构建在p GEX-4T-1质粒上,表达并纯化出这5个蛋白,首先用着5个蛋白与抗GCRV血清进行ELISA实验和然后运用ELISA实验。ELISA结果表明,VP56-2和VP56-4与其他组有显著的差异,说明这两片段具有很好的与抗体结合的能力。将VP56-2和VP56-4蛋白注射进草鱼体内获得抗VP56-2和VP56-4血清,运用抗VP56-2和VP56-4血清进行抗体中和实验,筛选出VP56潜在的抗原表位。结果显示,在抗血清稀释比在1:5000时VP56-4组细胞出现大量的死亡,而VP56-2组细胞死亡明显少于VP56-4,所以抗VP56-2血清有很好的抗GCRV的效果VP56-2时VP56的潜在的抗原位点。2.口服枯草芽孢杆菌B.s-CotC-VP56-2亚单位疫苗的制备我们首先将VP56-2片段构建在质粒p HT304上,然后提取了枯草芽孢杆菌WB600的DNA,将芽孢锚定蛋白CotC序列扩增了出来,运用一步克隆法将CotC构建到重组质粒p HT304-VP56-2上,随后运用SDS-PAGE和Western blotting方法检测VP56蛋白的表达情况。并且取诱导24h的芽孢液固定在玻片上后,分别与抗VP56小鼠血清和羊抗鼠Cy3标记的Ig G孵育,荧光显微镜下观察VP56-2蛋白在芽孢中的表达情况。然后取约10~6个CotC-VP56-2芽孢重悬,分别与抗VP56小鼠血清和FITC偶联的羊抗鼠Ig G孵育,运用流式细胞仪计数分析芽孢中VP56-2表达的率。SDS-PAGE和Western blotting结果显示:VP56-2蛋白表达在枯草芽孢杆菌芽孢外衣壳蛋白中;免疫荧光的结果显示,VP56-2蛋白表达在芽孢的表面;流式细胞仪的结果显示,枯草芽孢杆菌中的VP56-2蛋白的表达率为82.22%。综上所述,重组枯草芽孢杆菌B.s-CotC-VP56-2能成功的在芽孢表面表达出VP56-2蛋白,证明其具有成为口服亚单位疫苗的可能。3.活体效果检测为了检测重组枯草芽孢杆菌B.s-CotC-VP56-2的免疫效果,我们将400尾的草鱼分为4个实验组,分别为:Control、B.subtilis、B.s-CotC组、B.s-CotC-VP56-2组,每组为100尾鱼。在第1、3、7、14、21、28、30、32和36天从每组随机取4尾鱼进行取样检测,我们通过保护率分析,特异性抗体定量检测,肠道定植分析,定量免疫相关基因等方法确定各个实验组的保护效果。结果显示:B.s-CotC-VP56-2组的保护率（56%）显著的高于其他组,定量检测结果证实B.s-CotC-VP56-2组的特异性抗体水平高于其它组。B.s-CotC-VP56-2组的血清C3含量、溶菌酶和TSOD活性也升高,与其它组也有显著性差异。在攻毒后的q RT-PCR检测,B.s-CotC-VP56-2组的免疫基因IL-1β,TNF-α,IFN1和MHC II显著上调,并且结合病毒载量的检测结果可知B.s-CotC-VP56-2看可以抑制GCRV的复制,根据病理切片分析,B.s-CotC-VP56-2组组织病变最轻微,而B.subtilis和B.s-CotC组的病理变化与对照组相比稍轻了一些,也证明枯草芽孢杆菌也可以增强草鱼机体的免疫能力。综合活体检测实验结果来看,口服B.s-CotC-VP56-2的效果要优于其它组,这种方法的优势为可以有效提高感染GCRV II后草鱼的保护率、提升特异性抗体的表达量、有效激活免疫通路、保护组织器官、抑制病毒复制,而且枯草芽孢杆菌也增强了草鱼机体的免疫能力,其多方位的保护效果使草鱼面对GCRV II病毒感染时具有更强的抵抗力,从而达到更好的效果,为草鱼抗GCRV的疫苗的研制提供了一个新的有效的策略。
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