尿酸由嘌呤代谢产生,人体内尿酸不能被进一步降解。人体内正常的血尿酸水平在90μM到420μM之间,过高会引发高尿酸血症,会诱发痛风、慢性肾脏疾病、心血管疾病和糖尿病。随着高嘌呤饮食消费的增加,高尿酸血症的发病率在许多国家逐渐提升。目前,高尿酸血症已成为仅次于糖尿病的第二普遍的代谢性疾病。高尿酸血症通过减少尿酸产生或促进肾脏排尿酸来治疗,同时这也是导致人体患病的两大主要因素。目前有四种临床治疗方案:首先,通过饮食控制以减少嘌呤和核苷的摄入量。其次,利用黄嘌呤氧化酶抑制剂减少尿酸的生成,如非布司他等药物。第三,通过苯溴马隆等药物抑制肾小管对尿酸的重吸收。最后,通过注射外源性的尿酸氧化酶（UOX）在血液中降解多余的尿酸。目前,这些临床疗法有一定的局限性。限制饮食会显著降低患者的生活质量,同时需要长期坚持才能达到治疗效果,而使用的药物往往会有一些副作用。一些新的研究也被用于治疗高尿酸血症。研究者尝试用几种天然产物对高尿酸血症进行治疗。人体代谢生成的尿酸1/3通过肠道排出,肠道菌群也被证实参与了尿酸的进一步的代谢。一些研究分离了几株Lactobacillus属的乳酸菌,发现它们能够降解嘌呤或尿酸,可以缓解小鼠的高尿酸血症。因此,借助肠道微生物治疗高尿酸血症具有可行性。现有借助肠道菌进行高尿酸血症治疗的研究多集中在对自然存在细菌的挖掘和筛选,却鲜有利用合成生物学手段进行工程化改造的研究。相比于筛选得到的野生菌株,工程化菌株具备一些优势,包括可以针对特定区域进行靶向治疗、可以适度提高用药剂量、造成的全身效应小等。同时工程菌株还可用于探究微生物群、免疫系统、饮食之间的相互作用,寻找新的治疗策略。相关研究证明工程益生菌可以用于治疗高氨酸血症,苯丙酮尿症等代谢疾病。因此,利用工程化益生菌治疗高尿酸血症是值得探究的。UOX是尿酸降解过程中的关键酶,几种来自于微生物的UOX已用作临床检测尿酸的诊断试剂以及用于高尿酸血症的治疗,Bacillus subtilis中的PucL和PucM更是得到了广泛的研究。这些酶可用于构建具备尿酸降解能力的工程细菌。UOX催化尿酸降解需要氧气作为电子受体,其活性在氧气受限的肠道环境中可能会受到抑制。为了解决这一问题,来自Vitreoscilla sp.的细菌血红蛋白VHb可用于提高携氧量;H2O2是PucLM代谢尿酸的副产物,大肠杆菌过氧化氢酶KatG可以在去除H2O2的同时回补氧气。另外,还可借助大肠杆菌的尿酸转运蛋白YgfU,提高尿酸的降解效率。E.coli Nissle 1917（EcN）是一个可用的改造宿主。在一个世纪前,它就被用于治疗炎症性肠病和肠易激综合征。由于其安全特性和遗传可塑性,用它作为载体构建的工程菌被用作治疗多种疾病,如细菌感染、代谢紊乱等。最近,通过静脉注射,EcN能够作为向肿瘤部位递送抗癌药物的载体,这进一步证明EcN对人体具有较低的免疫原性,相对安全。基于以上研究背景,本论文构建了带有PucL、PucM、KatG、VHb和YgfU的工程化EcN菌株用于尿酸降解。并在小鼠体内探究了工程化EcN菌株的治疗效果。具体研究内容如下:（1）首先构建了快速代谢尿酸的工程菌。因为PucL的UriC结构域（PucLT）催化尿酸降解的第一步,后两步可以自发发生。我们在初步构建中选择了 PucLT,并使用不同质粒骨架和不同强度启动子表达PucLT。结果表明以pBBR1MCS-2质粒为骨架,在Ptrc启动子的控制下表达PucLT的菌株EcN::pMCS2-Ptrc-pucLT,其细胞破碎液的尿酸降解能力最强,但全细胞测定没有展现相同的结果。其次,我们对尿酸氧化酶进行了优化,通过表达完整的PucL以及PucM,以及对 PucL 突变（PucLM）,与 PucM 共表达,构建了 EcN::pMCS2-Ptrc-pucLM和 EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM 菌株。两株菌与 EcN::pMCS2-Ptrc-pucLT 比较,细胞破碎液的尿酸降解能力得到了显著提高。通过测定三株菌粗酶液的酶活参数,发现PucLMM的Vmax相较于PucLM提高了约3倍,但同时Km也提高了 3倍;全细胞测定的结果与细胞破碎液一致:PucLM和PucLMM降解能力都明显强于PucLT,但低浓度条件下PucLMM降解能力弱于PucLM。随后,引入了尿酸转运蛋白YgfU,根据全细胞测定结果,当YgfU与PucLMM共表达时,高尿酸浓度下EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-ygfU尿酸降解速率最快,同时低尿酸浓度条件下,尿酸降解速率也接近于PucLM体系。而后以EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-ygfU菌株为基础,进一步引入katG基因和 vhb 基因,构建了工程化 EcN 菌株 EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-vhb-ygfU-katG。在常氧条件下,引入两个基因的工程化EcN菌株降解尿酸速率比未引入的菌株稍慢,但该体系产生的ROS明显下降,引入KatG和VHb也提高了系统中氧气供应水平,缓解了氧气损失。通过控制体系溶氧模拟肠道环境,结果表明,当溶解氧受限时,EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-vhb-ygfU-katG可以正常完成尿酸降解,但当缺少这两个基因时,降解能力不能持续。（2）为测定工程化EcN菌株能否直接在小鼠肠道中降解尿酸,我们通过灌胃的方式向小鼠注入尿酸,在起始时刻尿酸会在小鼠的胃和十二指肠中累积;30分钟后,尿酸主要积累在小鼠的空肠中。而在灌胃工程化EcN菌株后,空肠处未出现尿酸积累。证明菌株在小鼠肠道内能够有效降解尿酸。之后,进一步测试了四种已报导的方法,尝试在小鼠中建立高尿酸血症模型。仅当使用7d-1PO方法时,即每天灌胃75mg/kg腺嘌呤,连续灌胃7天,并在最后一次灌胃腺嘌呤后的1小时,腹腔注射250 mg/kg氧嗪酸钾（PO）,小鼠的血尿酸浓度虽然比对照组提高了 2.2倍。但在灌胃工程化EcN菌株后,并没有缓解7d-1PO小鼠的高尿酸血症,也没有影响小鼠肠道中的尿酸浓度。随后分析了工程化EcN菌株未能在传统高尿酸血症小鼠模型中发挥作用的原因,7d-1PO模型小鼠的血尿酸浓度仅为45.1μM,该浓度明显比人体尿酸浓度低10倍。测定不同尿酸浓度条件下工程化EcN菌株的降解能力后发现,在48.6μM尿酸浓度下,工程化EcN菌株的尿酸降解速率比1095.8 μM尿酸浓度下慢20倍。PO是构建传统高尿酸血症模型的通用试剂,我们发现PO进一步抑制了工程化EcN菌株的尿酸降解能力。这两个因素表明,传统的高尿酸血症小鼠模型不太适合测试工程化EcN菌株,需要构建更合适的小鼠模型。（3）为将小鼠的血尿酸增加到与人类相当的水平,我们将70mg/kg尿酸溶液直接注射到小鼠血液中,发现其血尿酸浓度被提升至～1mM,并且该浓度可以维持1小时左右,之后会随时间剧烈下降。这种方法可以构建出急性高尿酸血症小鼠,我们将其命名为UA-injection方法,并用于后期对工程菌功能的测试。首先测试了灌胃的治疗方法。向UA-injection高尿酸小鼠体内灌胃1.0× 1011 CFU 的 EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-vhb-ygfU-katG 菌株后,1 小时内迅速降低了UA-injection高尿酸小鼠的血尿酸水平,说明灌胃工程化EcN菌株能够有效缓解小鼠的高尿酸血症。随后测试了将EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-vhb-ygfU-katG菌株注射到血液中能否治疗高尿酸血症。当在缓冲液、小鼠血清、人类血清以及全血中分别引入1.0×107 CFU/mL,1.0×108 CFU/mL 和 1.0×109 CFU/mL 的工程化 EcN 菌株后,本底或者额外添加的尿酸能被快速降解,并且随着细菌用量的提高,降解速率会显著提升;在老年和青年人血中添加菌株（1.0×108 CFU/mL）时,两组中尿酸都被迅速降解,反复添加尿酸,降解速率没有改变。将5.0×108CFU和1.0×109 CFU的工程化EcN菌株分别注射到UA-injection高尿酸血症小鼠体内,发现治疗组的血尿酸水平出现明显下降。引入1.0× 109 CFU工程化EcN菌株尿酸降解明显更快。但1.0× 109 CFU的菌株用量会增加小鼠的死亡率,而注射5.0×108 CFU的小鼠生活状况良好。将工程化EcN菌株注入小鼠静脉8小时后,工程化EcN菌株仍然可以在UA-injection高尿酸血症小鼠中降解尿酸。此外,当向小鼠注射5.7 mg/kg尿酸时,小鼠的起始时刻血尿酸浓度会增加到80 μM,在10分钟后会被迅速代谢至正常水平。通过静脉注射或灌胃工程EcN菌株进行治疗时,起始点的尿酸水平出现了明显下降。随后我们通过血液注射和灌胃比较了含有vhb和katG的工程化EcN菌株与不含两基因的菌株对UA-injection高尿酸小鼠的治疗作用。发现含有vhb和katG的工程化EcN菌株的尿酸降解速率更快,H2O2去除率更高。进一步说明VHb和KatG帮助菌株维持了氧气浓度,同时降低了 ROS。综上,我们构建的工程化EcN菌株在常氧和低氧条件下均能够降解尿酸。通过直接静脉注射尿酸,我们构建了 UA-injection高尿酸血症小鼠,工程化EcN菌株能够降解小鼠肠道和血液中的尿酸。这一结果证明利用肠道菌可以治疗高尿酸血症。同时我们提出了将EcN直接应用到血液中治疗代谢紊乱这一新思路,但还需要更多的优化和努力才能实现。