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背景近几年,椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IVDD）已逐渐成为一个世界性的健康问题,其具有发病隐匿的特点,多数患者出现症状后采取保守治疗往往效果不佳,外科治疗虽可缓解症状,但难以扭转IVDD的发展,且还会导致多种并发症。因此,通过基因干预、生长因子等手段阻断IVDD逐渐获得相关研究领域的关注。肿瘤坏死因子-α（tumornecrosis factor-α,TNF-α）在退变髓核区域的表达增加,导致椎间盘的蛋白多糖加快分解,合成受阻,促进椎间盘的炎症进展。此外,TNF-α还具有激活细胞内NF-κB通路的作用,进而引起髓核细胞的衰老退变,而衰老的髓核细胞又参与IVDD的发病过程。低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）主要在低氧组织环境中发挥作用,髓核是典型的缺氧和无血管环境。研究发现缺乏HIF-1α基因的小鼠,其髓核细胞凋亡,伴随椎间盘的严重病变;随IVDD进入后期,新生血管的形成使椎间盘内的氧浓度升高,HIF-1α的表达水平显著降低。最新研究结果显示,HIF-1α能够显著抑制由机械负荷过大所诱导的髓核干细胞的凋亡,且严重退变的髓核细胞中HIF-1α的表达水平显著低于正常的髓核细胞。但是,HIF-1α对暴露于TNF-α的小鼠原代髓核细胞（mouse primary nucleus pulposus cells,MNPCs）的影响及其潜在机制尚不清楚。目的研究TNF-α对MNPCs炎症反应、合成分解代谢、细胞凋亡和线粒体功能障碍的影响,研究HIF-1α对减缓TNF-α导致的MNPCs的炎症反应、细胞代谢、细胞凋亡、线粒体功能障碍等的作用,分析其具体作用机制;此外,通过新西兰大白兔IVDD模型进一步验证HIF-1α对IVDD的保护作用。方法体外实验部分:由C57小鼠（6-8周龄）椎间盘组织分离培养MNPCs,并随机分为对照组、TNF-α组、TNF-α+ML228组和TNF-α+Oltipraz组。对照组在常氧条件下培养;TNF-α组:MNPCs加入TNF-α（10 ng/mL）继续在常氧条件下培养;TNF-α+ML228组:MNPCs 加入 TNF-α（10 ng/mL）和 ML228（1uM）继续在乏氧条件下培养;TNF-α+Oltipraz组:MNPCs加入TNF-α（10ng/mL）和Oltipraz（10uM）继续在乏氧条件下培养。培养24 h后采用实时荧光定量PCR方法进行COX-2、iNOS、Col-2、MMP-13、ADAMTS-5、Bax、Caspase-3和Bcl-2的mRNA表达水平的检测,应用免疫荧光染色测定iNOS、COX-2和MMP-13的蛋白水平,并进行活性氧（reactive oxygen species,ROS）检测、JC-1检测以及MitoTracker检测,选取TUNEL染色以及流式细胞术测定细胞凋亡水平;培养48 h 后应用 Western blot 方法进行 COX-2、iNOS、Col-2、Aggrecan、MMP-13、ADAMTS-5、Bcl-2、BAX、Caspase-3 和 C-Caspase-3 蛋白水平的测定。动物模型实验部分:将12只新西兰大白兔随机分成HIF-1α组、Oltipraz组、PBS组和Sham组。每只新西兰大白兔选择两个节段的椎间盘为手术节段。HIF-1α组:3只新西兰大白兔,向其椎间盘内注入HIF-1α重组蛋白;Oltipraz组:3只新西兰大白兔,向其椎间盘内注入HIF-1α的抑制剂。剩余的6只选择分别向椎间盘内注入PBS作为PBS组,其余腰椎间盘为Sham组。术后14周,耳缘静脉注射10%水合三氯乙醛,3 mL,待麻醉起效后行X线检测,采用椎间隙百分比进行比较;术后3、6、11、14周,4组大白兔均接受核磁（Magnetic Resonance Imaging,MRI）检查,T2加权像正中矢状位的MRI信号强度进行比较;术后14周,X线及MRI检查后行安乐死,完整截取目标椎间盘节段,使用H＆E染色试剂盒（EE0012,Sparkjade）进行H＆E染色以评估髓核的形态变化,使用番红O染色试剂盒（G1371,Solarbio）进行番红O染色以检测蛋白多糖的变化,样本的胶原蛋白损失情况用Masson三色染色试剂盒（G1340,Solarbio）确定。结果:①MNPCs暴露于TNF-α后,COX-2和iNOS的表达增加,诱发炎症反应,使用HIF-1α激活剂ML228可以显著降低由TNF-α诱发的COX-2和iNOS的高表达,而使用HIF-1α抑制剂Oltipraz不会降低由TNF-α诱发的COX-2和iNOS的高表达。②MNPCs暴露于TNF-α后,其Col-2和Aggrecan的表达下降,MMP-13和ADAMTS-5的表达增加,合成代谢被抑制,分解代谢增强,使用HIF-1α激活剂ML228可以显著上调由TNF-α诱发的Col-2和Aggrecan表达水平的降低、显著下调由TNF-α诱发的MMP-13和ADAMTS-5表达水平的升高,而使用HIF-1α抑制剂Oltipraz则不能改变由TNF-α所诱导的代谢变化。③MNPCs 暴露于 TNF-α后,其 Bcl-2 合成减少,而 Bax、Caspase-3 和 C-Caspase-3合成增加,细胞凋亡,使用HIF-1α激活剂ML228可以阻断TNF-α诱发的Bcl-2表达降低,逆转TNF-α诱发的Bax、Caspase-3和C-Caspase-3表达异常,抑制细胞的凋亡,而使用HIF-1α抑制剂Oltipraz则不能改变由TNF-α所诱导的细胞凋亡的变化。④MNPCs暴露于TNF-α后,其ROS合成增加,线粒体的膜电位下降,致使其功能异常。使用HIF-1α激活剂ML228后,可以抑制ROS合成,逆转TNF-α导致线粒体的损伤,而使用HIF-1α抑制剂Oltipraz则不会改变由TNF-α诱发的ROS合成增加及线粒体功能障碍。⑤X线检查和MRI检查显示,外源补充HIF-1α可以延缓退变椎间盘高度的丢失,从而减轻IVD的变性表型。HE染色结果显示,外源补充HIF-1α可以降低退变椎间盘的形态学退变评分。番红O和Masson染色结果显示,外源补充HIF-1α可以减少IVDD过程中蛋白多糖和胶原蛋白的损失,抑制HIF-1α的表达则会加剧这种情况。结论在椎间盘的退变的发生发展中,炎症介质参与了椎间盘的退变。HIF-1α可以通过减少COX-2和iNOS等炎性物质的表达,减轻髓核细胞的炎症反应。同时通过促进Col-2和Aggrecan等表达,促进髓核细胞的合成代谢,促进蛋白多糖及胶原蛋白等细胞外基质的合成,对椎间盘起到保护性作用。减少MMP-13和ADAMTS-5的表达,有效的抑制蛋白多糖、胶原蛋白等细胞外基质的降解,延缓椎间盘的退变。HIF-1α还能够促进抑凋亡基因Bcl-2的表达,降低促凋亡基因Bax、Caspase-3和C-Caspase-3的表达,减少髓核细胞的凋亡,保护椎间盘内的髓核细胞。HIF-1α降低线粒体ROS的合成、升高线粒体膜电位,保护线粒体的功能。线粒体是细胞代谢的能量工厂,在调控细胞的凋亡、细胞的代谢等方面发挥着重要的作用,我们认为HIF-1α通过线粒体途径减轻炎症反应,促进合成代谢、抑制分解代谢,减轻细胞凋亡,从而在IVDD中发挥保护性作用。外源补充HIF-1α可以延缓IVDD的高度丢失,减轻椎间盘的变性表型,降低IVDD的形态学退变评分,减少IVDD过程中蛋白多糖和胶原蛋白的损失,从而对体内减轻髓核细胞退变具有保护作用。HIF-1α可能会成为治疗腰椎间盘退变性疾病的新的靶点之一。