研究背景肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, Kpn)属于肠杆菌科克雷伯菌属,最早由Friediander于1893年从大叶性肺炎患者的肺组织中首次分离到。克雷伯菌为革兰阴性杆菌,无鞭毛,无芽孢,在营养丰富的培养基上可形成荚膜。多数菌株有菌毛,具有菌体抗原、荚膜抗原、菌毛抗原等多种主要抗原成分。该菌为兼性厌氧菌,营养要求不高,在培养基上可形成较大、凸起、灰白色粘液型的菌落。典型的肺炎克雷伯菌是一种条件致病菌,它能使免疫力低的人群易获得医院感染。该菌在正常人口咽部的带菌率为1%-6%,但在住院病人中可高达20%,是糖尿病病人和慢性阻塞性肺病患者并发肺部感染的潜在危险因素。近年来,由于这些典型的肺炎克雷伯菌株出现了耐药情况,且呈上升趋势,使得该菌在临床治疗上极为棘手。最近有报道称,一种新的高毒性的肺炎克雷伯菌变种已经出现,它的临床特征为能在年轻的健康人群中引发严重的、威胁生命的社区获得性感染。这些感染包括肝脓肿、肺炎、脑膜炎、感染性眼内炎和转移性葡萄膜炎。如果这些菌株也出现了耐药趋势,那么临床治疗将会面临巨大的挑战。因此,临床迫切需要一种快速,准确和简便的方法来鉴定出病原菌,以辅助临床选择有效的抗生素来减少致死率和耐药菌株的出现。细菌培养鉴定是目前常用的检测肺炎克雷伯菌的方法,一般需要经过分离培养,生化反应鉴定,血清学鉴定,肠毒素测定等步骤。尽管临床上已有半自动和全自动微生物鉴定和药敏系统(例如Vitek系统),但整个培养鉴定过程至少需要48-72小时,耗时耗力,不能满足目前临床快速诊断的要求。实时荧光定量PCR技术是目前常用的分子诊断技术,与常规细菌培养法比较,它具有特异性强、重复性好、定量准确、大批量检测、自动化程度高等优点。本研究旨在建立检测肺炎克雷伯菌的荧光定量PCR方法,对其敏感性、特异性等进行评价,并应用此方法对临床疑似肺炎克雷伯菌感染的患者的痰液标本进行检测,为其临床应用奠定基础。方法：1建立实时荧光定量PCR检测肺炎克雷伯菌的方法,通过检测不同浓度梯度的肺炎克雷伯菌标准株(ATCC700603),15种非肺炎克雷伯菌及重复检测低、中、高三个浓度的肺炎克雷伯菌标准株(ATCC700603)来评价其线性、敏感性、特异性及精密度。2收集2014年3月至7月期间浙江大学附属第一医院疑似肺炎克雷伯菌感染住院病人255例痰液标本。用建立的实时荧光定量PCR法检测标本,与细菌培养法比较,分析敏感性和特异性。结果：1已建立的实时荧光定量PCR法在肺炎克雷伯菌浓度103-107copies/ml范围内有良好的线性,线性相关系数为0.998。2实时荧光定量PCR法的最低检测限为1×103copies/ml。3本方法检测其它常见致病菌(金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、甲型溶血性链球菌、绿脓杆菌、大肠埃希杆菌等)均为阴性,无交叉反应,证实有较好的特异性。4实时荧光定量PCR法对低、中、高三个浓度标准品重复检测的结果如下：低浓度三次批内变异系数分别为1.05%、1.17%、1.11%,批间变异系数为1.26%；中浓度三次批内变异系数分别为1.23%、2.84%、1.66%,批间变异系数为1.97%；高浓度三次批内变异系数分别为1.01%、1.15%、1.25%,批间变异系数为1.28%。5实时荧光定量PCR法检测255例临床痰标本中,检测出82例肺炎克雷伯菌阳性(阳性检出率为32.16%,),细菌培养鉴定出69例阳性(阳性检出率为27.06%)。两种方法比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论：成功建立检测肺炎克雷伯菌的实时荧光定量PCR方法,该方法是一种敏感、特异、精密度高的检测肺炎克雷伯菌的方法。与传统细菌培养鉴定法相比,实时荧光定量PCR法的阳性检出率略高,检测速度快,人力花费少。该方法的建立为临床诊断肺炎克雷伯菌感染提供了新的快速检测方法。