凝结芽孢杆菌催化还原糠醛制备糠醇研究

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生物基产品糠醇是糠醛加氢还原产物,被广泛用于精细化工品和聚合物工业。目前化学法加氢还原糠醛制备糠醇技术虽然相对成熟,但此方法存在反应温度高、需要额外的氢气、环境污染等弊端。生物催化因具备绿色、温和、高效的催化条件有望代替传统的化学方法。目前鲜有关于微生物全细胞催化还原糠醛制备糠醇的报道。基于此,本论文首先围绕全细胞催化还原糠醛制备糠醇展开研究,考察了凝结芽孢杆菌NL01对糠醛的耐受性及耐受机理,建立了凝结芽孢杆菌NL01全细胞催化还原糠醛制备糠醇体系;为实现高底物浓度下糠醇的生物合成,筛选获得生物相容性较高的有机溶剂,构建了水/有机相双相体系下全细胞催化还原糠醛制备糠醇;并在此基础上初步探索了以廉价的、可再生的玉米芯为原料利用氯化胆碱类低共熔溶剂/有机相双相体系“一步法”制备糠醛的可行性,通过有机相原位萃取糠醛液与富含葡萄糖的水解液耦合实现了以木质纤维为原料生物合成糠醇工艺,研究结果为木质纤维原料生物合成制备糠醇提供基础。凝结芽孢杆菌NL01能够耐受42 m M糠醛,在厌氧条件下具有定向生物还原能力,可将糠醛转化为毒性较小的糠醇。以葡萄糖作为辅助底物全细胞催化糠醛制备糠醇转化率最高,同时20 g/L葡萄糖可副产乳酸15.3 g/L。当糠醛浓度42 m M,葡萄糖20 g/L,细胞浓度9 mg(干重)/m L,温度50°C下反应3 h糠醛转化率可达95.8%,糠醇选择性为85.5%。采用分批补料可以提高糠醇生产量,催化反应24 h糠醇浓度达到98.4 m M,糠醛转化率为92.0%,糠醇选择性96.0%。产物糠醇对凝结芽孢杆菌NL01的抑制浓度在80-120 m M,采用水/有机相双相体系能够有效移除糠醇缓解产物浓度过高对细胞的毒性。比较发现邻苯二甲酸二辛酯为构建双相催化还原糠醛制备糠醇体系的适宜溶剂。在较高底物浓度208m M糠醛下,葡萄糖为40 g/L,细胞浓度200 mg(湿重)/m L,反应6 h糠醇浓度达181 m M,糠醛转化率为98.8%,糠醇选择性为88.1%。在两相体系进行分批补料糠醛总浓度为310 m M,葡萄糖与糠醛摩尔比为1.28,反应8.5 h糠醇浓度达到265 m M,糠醛转化率为94.7%,糠醇选择性为91.0%,同时实现了糠醇和乳酸的多联产,乳酸产量为64.2 g/L,糖酸转化率达90.4%。建立了DES/邻苯二甲酸二辛酯双相转化木糖制备糠醇工艺。发现100°C下反应30min,氯化胆碱-乳酸为介质时糠醛产率为16.2%,糠醛转化率最高达到98.2%。固体载量为12%时可不加辅助底物直接利用木糖制备糠醛中的残余木糖实现生物还原法辅酶再生,木糖糠醇得率为15.2%;开发了低共熔溶剂介质下以玉米芯为原料“一步法”制备糠醛技术。采用酸化氯化胆碱-草酸/邻苯二甲酸二辛酯体系在温度为120°C条件下反应30 min糠醛产率为45.4-46.0%。并在此基础上构建了偶联酶解液和含有糠醛有机相双相体系的玉米芯制备糠醇工艺。酸性氯化胆碱-草酸/邻苯二甲酸二辛酯体系可实现糠醛的原位分离,而剩余的玉米芯渣进一步酶解得到的葡萄糖液可用于有机相糠醛转化的辅酶再生。酸化氯化胆碱-草酸可以继续回用3次仍保持着较高的活性。以0.5 g玉米芯为原料制备糠醇时,糠醛转化率最高为100%,糠醇选择性为78.6%。成功实现了农林废弃物的高值化利用。
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