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帕金森病(Parkinsons disease,PD)是发病率居第二位的常见的神经系统变性疾病,其病理特征主要表现为黑质多巴胺(Dopamine,DA)神经元的丢失和路易小体(Lewybody,LB)的形成。国际上关于PD的发病机制和治疗方面的研究不少,但没有一个系统全面的认识,也缺乏针对疾病的有效治疗手段。常用的治疗策略仅仅局限于对症治疗,尽量减轻患者的临床症状,这类治疗手段并不能够从根本上逆转PD的发生和发展。胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES细胞)是具有多种分化潜能的细胞,能够诱导分化成为特定的细胞类型,这种特性使其在细胞替代治疗方面具有广阔的前景。近几年国外许多实验室开始研究ES细胞向DA神经元的定向诱导分化,期望能用于PD患者DA神经元缺失的替代治疗。但目前ES细胞分化过程中的分子机制还不清楚,诱导ES细胞精确定向分化的技术还不成熟,且分化成为DA神经元的比例仍然偏低。本实验室前期的研究结果证明同源结构域转录因子(Paired-likehomeodomain transcription factor3,Pitx3)不仅在DA神经元发育中具有非常重要的作用,而且能上调对中脑DA神经元存活起重要作用的脑源性神经营养因子(Brainderived neurotrophic factor,BDNF)和胶质源性神经生长因子(Glial cell derivedneurotrophic factor,GDNF)的表达,这表明Pitx3是一个潜在的治疗PD的靶点。在此基础上,本论文通过在星型胶质细胞中过表达Pitx3观察其对BDNF和GDNF的调节,并研究了Pitx3转染的星型胶质细胞的条件培养液(Conditional medium,CM)对DA神经元损伤的保护作用;另一方面通过建立ES细胞向DA神经元分化以及可调控目的基因表达的GeneSwitch技术平台,进一步研究Pitx3对DA神经元分化的影响;同时,我们构建了酪氨酸羟化酶(Tyrosine dehydroxylase,TH)启动子启动的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)报告系统,并用流式细胞仪进行筛选得到了纯度非常高的DA神经元,分别检测了纯化的DA神经元、非DA神经元以及神经前体细胞的microRNA(miRNA)表达谱,并根据其在不同细胞中的相对表达水平发现了多个变化比较明显的miRNA,我们对其中一个miRNA——miR-132进行了较深入的研究。
本论文分别从以下三个部分进行论述:
第一部分:星型胶质细胞中过表达的Pitx3能够调节BDNF和GDNF的水平,保护鱼藤酮引起的DA神经元损伤
我们证明在原代培养的星型胶质细胞中过表达Pitx3能在mRNA水平和蛋白表达以及分泌水平上调BDNF和GDNF的表达。通过对Pitx3转染的星型胶质细胞的CM进行收集并对原代培养的腹侧中脑(ventral mesencephalon,VM)DA神经元损伤进行保护实验,我们发现CM能够显著保护鱼藤酮诱导的DA神经元损伤,并且通过抗体中和实验证明BDNF和GDNF在此保护中发挥关键作用。
第二部分:诱导表达的Pitx3能够促进小鼠ES细胞向DA神经元分化
我们建立了稳定的ES细胞向DA神经元分化的技术平台以及能够在特定时间点表达目的基因的GeneSwitch平台。通过将Pitx3表达载体稳定转染到ES细胞中建立可以诱导Pitx3表达的ES细胞系,在不同时间点表达的Pitx3对DA神经元分化和发育的调节也不相同,在分化的第四天和第六天能够更好的促进DA神经元分化。并且在不同时间点表达的Pitx3也能够促进BDNF和GDNF的表达。
第三部分:ES细胞分化的DA神经元的miRNA表达谱以及miR-132在DA神经元分化中的作用
通过建立TH基因启动子启动的GFP报告细胞,我们将分选的GFP阳性的DA神经元富集的细胞、非DA神经元和神经前体细胞分别建立其miRNA表达谱,其中有超过20个miRNA在不同细胞中的表达变化较大。通过进一步的生物信息学和荧光素酶报告基因分析以及western blot和分化验证,我们认为miR-132通过调节重要转录因子Nurr1的表达来调控DA神经元的发育和分化。