论文部分内容阅读
第一部分VEGF在人喉鳞状细胞癌细胞(Hep-2)中的表达及意义
目的:检测人喉鳞状细胞癌细胞株(Hep-2)中是否有VEGF基因的表达以及表达的水平，为后续的研究奠定基础。
方法:应用RT-PCR方法检测人喉鳞状细胞癌细胞株(Hep-2)中VEGF基因的mRNA的表达；Hep-2细胞的总RNA使用Trizol提取，逆转录反应使用OligodT，每个反应使用等量的RNA(5μ1)，VEGF引物由武汉伯杰生物技术有限公司合成，上游引物：5CAGCCCCAGCTACCACCTC3；下游引物：5TCTTCCTCCTCCCCCTCCTC3，VEGFcDNA中的扩增产物大小约268bp。内参照选择β-actin，上游引物：5GCACTCTTCCAGCCTTCCTTC3，下游引物：5CTGTCACCTTCACCGTTCCA3，Tm62度，扩增产物大小约508bp。电泳检测PCR产物，在紫外灯下观察结果，与Marker(DL2000)对比分子量，采用quantiscan软件对电泳图像扫描分析并计算VEGF与β-actin吸光度(A)。
结果:应用RT-PCR方法检测发现人喉鳞状细胞癌细胞株(Hep-2)中VEGF基因有很强的表达，表明VEGF在人喉鳞状细胞癌的发生、生长和转移过程中起到重要的作用。
结论:
1.RT-PCR方法检测提示人喉鳞状细胞癌细胞株(Hep-2)中VEGF的mRNA有很强的表达。
2.VEGF基因可能在人喉鳞状细胞癌的发生、生长和转移过程中起到至关重要的作用。
第二部分使用siRNA表达框架的方法对靶向VEGF特异性设计的siRNA序列进行筛选
目的：设计合成特异性干扰人VEGF基因的siRNA序列。
方法：在Genebank人K-ras基因组全序列中，筛选符合合成siRNA序列要求的序列，用BLAST工具排除同源序列；从这些序列中筛选符合siRNA表达框架法设计要求的序列作为其PCR扩增的特异性下游引物。
结果：按照以上要求我们挑选了四个siRNA序列，这四个序列分别位于第1130位点、1498位点、1366位点和1492位点。1130位点的正义引物序列为5AAGGAGGAGGGCAGAATCATC31130位点的反义引物序列为5AAGATGATTCTGCCCTCCTCC31498位点正义引物序列为5AAGCGCAAGAAATCCCGGTAT31498位点的反义引物序列为5AAATACCGGGATTTCTTGCGC31366位点正义引物序列为5AAACCTCACCAAGGCCAGCAC31366位点的反义引物序列为5AAGTGCTGGCCTTGGTGAGGT31492位点正义引物序列为5AAACGAAAGCGCAAGAAATCC31492位点的反义引物序列为5AAGGATTTCTTGCGCTTTCGT3阴性对照正义引物序列为5AAACGAACAGGCAAGAAATCC3阴性对照反义引物序列为5AAGGATTTCTTGCCTGTTCGT3
结论：我们在人VEGF基因组全序列中找到了符合siRNA表达框架法设计要求的四个siRNA序列并设计了阴性对照。
第三部分使用siRNA表达框架的方法进行扩增的PCR产物在人喉鳞状细胞癌细胞株(Hep-2)中的转染
目的：应用siRNA表达框架法扩增PCR产物并将扩增的产物转染入人喉鳞状细胞癌细胞株(Hep-2)。
方法：以实验第二部分筛选的siRNA序列作为下游引物，用PCR扩增的DNA产物构建不同位点的siRNA表达框架，产物纯化后利用脂质体转染入Hep-2细胞，转染48小时后在倒置显微镜下观察细胞形态的变化。
结果：
1.PCR扩增出正确的DNA产物；2.转染后48小时后倒置显微镜下观察可见1366位点干扰的细胞组生长速度明显减慢，细胞可见皱缩、变圆并开始脱落；而其他三个位点的细胞形态学上未见明显的改变，生长速度和形态与正常细胞的生长状态相比没有明显的区别；阴性对照细胞和空转细胞的生长速度都正常，形态完整、饱满，未表现出凋亡形态。
结论：
1.siRNA表达框架中PCR扩增的DNA产物纯化后在电泳图上位于正确的位置；
2.带有1366位点siRNA序列的DNA片断转染入细胞后，细胞生长和形态发生特异性变化；而带有其他位点siRNA序列的DNA片断转染入细胞后，细胞生长和形态无明显改变。
第四部分转染后的人喉鳞状细胞癌细胞株(Hep-2)VEGF表达的检测及其凋亡的检测
目的：从功能和蛋白水平来检测和评价靶向VEGF基因的siRNA表达框架转染喉鳞状细胞癌细胞株(Hep-2)后对其生长的影响以及VEGF基因被封闭的情况；探讨RNA干扰技术抑制人喉鳞状细胞癌细胞生长的效果以及作为肿瘤基因治疗工具的应用前景。
方法：应用流式细胞仪检测人喉鳞状细胞癌细胞Hep-2在siRNA干扰下凋亡细胞的变化，应用RT-PCR、免疫荧光、Westernblot法分别检测VEGF基因在被siRNA干扰下mRNA和蛋白表达水平的改变。
结果：对照组细胞生长正常，转染1366位点的siRNA片段实验组的凋亡细胞数明显增多，VEGF基因的mRNA和蛋白表达水平较对照组明显减弱；而转染入其它三个位点siRNA片段的细胞凋亡数与对照组无明显差别，检测VEGF基因的mRNA和蛋白水平较对照组无明显差别。
结论：针对VEGF基因标准序列设计的四段siRNA表达框架中，1366位点的siRNA片段能强有效地抑制VEGF基因的复制和表达，几乎能达到“基因敲除”的效果，从而抑制人喉鳞状细胞癌细胞的分裂增殖；说明VEGF基因与人喉鳞状细胞癌细胞的增殖和凋亡有紧密的关系，而RNAi技术是一种有效抑制肿瘤生长的工具。