第一部分胚胎干细胞分泌因子对肝纤维化相关细胞的作用目的：肝纤维化过程中,肝星状细胞(Hepatic stellate cell, HSC)和肝实质细胞在其中起着重要的作用,尤其是肝星状细胞,在肝脏损伤早期被激活,转变为成肌纤维样细胞,分泌细胞外基质蛋白,增加细胞外基质的沉积,抑制其降解。我们研究胚胎干细胞分泌因子对肝星状细胞的作用,有助于了解其对肝纤维化的影响。方法：由于直接移植胚胎干细胞有形成畸胎瘤等危险,我们采用含胚胎干细胞分泌因子的上清培养液,即胚胎干细胞条件培养基(ESC-S),研究其对对肝星状细胞和肝实质细胞的作用。用ESC-S处理细胞后,观察细胞的生长和形态的变化,检测其中基因的改变和蛋白表达的变化情况。结果：胚胎干细胞条件培养液可活化肝星状细胞,促进其显著增殖,细胞中的活化标志物蛋白显α-SMA和desmin著升高。RSC-S还可能通过上皮-间质转化(EMT)来促进肝星状细胞的激活。M1型巨噬细胞的分泌培养液对肝星状细胞有促进作用,而M2c型巨噬细胞的分泌培养液有抑制肝星状细胞活化的作用。ESC-S对肝实质细胞有抑制其生长,诱导其凋亡的作用。结论：胚胎干细胞分泌的细胞因子对肝细胞有正向调节作用,而对肝细胞有损伤作用。第二部分胚胎干细胞分泌因子对小鼠肝纤维化的影响目的：在前面的实验中我们可知ESC-S对肝星状细胞有促进和活化的作用,为进一步明确ESC-S对肝脏纤维化的作用,在小鼠体内研究其对肝脏功能的影响。方法：我们构建了四氯化碳肝纤维化模型,在注射四氯化碳的同时给予小鼠Con-M或ESC-S注射,共持续6周时间。6周后,对肝脏组织进行冰冻切片,同时对这些肝组织切片进行Sirius Red染色,观察两组肝组织中纤维化的程度。为进一步探讨ESC-S对小鼠肝脏的影响,我们将ESC-S通过腹腔注入小鼠体内,每周注射3次,每次注射1ml,持续6周时间。6周后,将小鼠予以安乐死,从下腔静脉取血,并获取肝脏标本。结果：在ESC-S与四氯化碳共同注射的小鼠肝脏中,HSC的活化标志物明显增多,胶原蛋白在细胞外基质中的沉积亦增加。在ESC-S独立处理组小鼠中,血清肝酶升高明显,细胞外基质的沉积也较对照组多。ESC-S处理的小鼠肝脏中有较多的巨噬细胞富集。结论：ESC-S能够启动并导致肝纤维化,富集M1型巨噬细胞到肝内,加速肝脏损伤,而且在原有肝脏损伤的基础上,辅助和加速了肝脏的纤维化。第三部分ESC-S导致肝纤维化的作用机制研究目的：在前期的实验研究表明,ESC-S在体外有促进肝纤维化的潜能,而在动物体内我们发现ESC-S确实有导致肝纤维化的作用。因此,我们研究其可能的作用机制。方法：在体外实验中我们发现,ESC-S可引起钙调磷酸酶(Calcineurin,CN)及相关通路蛋白的下调,我们对钙调磷酸酶基因敲除的小鼠和正常对照的小鼠,采用四氯化碳和胆总管结扎的方法建立两个肝纤维化的模型,研究CN在肝纤维化中的作用。同时我们分析了胚胎干细胞分泌的细胞因子,研究促进肝纤维化的细胞因子和可能的信号通路机制。结果：钙调磷酸酶基因敲除(CN-KO)小鼠比正常对照(WT)小鼠更容易导致肝纤维化,基因敲除小鼠中,细胞外基质中胶原蛋白的沉积明显增多,尤其是1型胶原蛋白,说明钙调磷酸酶在抑制肝纤维化中起着重要作用。通过体外实验,我们发现VEGF在促进肝星状细胞增殖和肝纤维化中起着主要的作用,其一方面通过上调肝星状细胞中TGF-β1的表达,而TGF-β1通过自分泌途径磷酸化星状细胞内的Smad2/3转录因子,活化肝星状细胞,分泌细胞外基质等促肝纤维化的因子；另一方面,肝星状细胞中的钙调磷酸酶下调,增加了STAT3转录因子的总量和磷酸化水平,通过STAT3信号通路激活肝星状细胞。结论：胚胎干细胞分泌因子中的血管内皮生长因子(VEGF)在促进肝纤维化中起着重要的作用,它通过TGF-β1-Smad2/3和Calcineurin-STAT3信号通路在肝脏中起作用。