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核开关(Riboswitch)是一段具有调控功能的RNA序列；它通常位于mRNA分子的5’非翻译区(5’untranslated regions,5’UTR),可以不依赖任何蛋白的参与,通过与小分子物质的直接结合来调控该mRNA的转录或/和翻译。核开关是近10年才发现的一种全新的基因表达调控机制。尽管在植物、真菌和古细菌中也存在核开关,但目前已鉴定的大多数核开关都存在于细菌中。迄今为止,人们已经在大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等生物中鉴定了硫胺素焦磷酸核开关(Thiamine pyrophosphate Riboswitch, TPP Riboswitch)、黄素单核苷酸核开关(Flavin mononucleotide Riboswitch, FMN Riboswitch)、S-腺苷甲硫氨酸核开关(S-adenosyl methionine Riboswitch, SAM Riboswitch)等19种核开关；它们在调控维生素、氨基酸、核苷酸和辅酶合成等基础代谢过程中发挥着极其重要的作用。尽管目前核开关存在的广泛性和功能的重要性已经逐步得到确认,但是,在包括十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris,简称Xcc)在内的植物病原细菌中,有功能的核开关尚未见报道。S-腺苷甲硫氨酸核开关(以下简称SAM核开关)通常位于细菌编码甲硫氨酸(Methionine)或半胱氨酸(Cysteine)生物合成途径的关键酶的mRNA的5’非翻译区,它通过与细胞中S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)的结合来调控这些酶的表达。目前已经在枯草芽孢杆菌、遍在远洋杆菌(Candidatus Pelagibacter ubique)、放线菌(Actinomycetes)等细菌中鉴定了5种类型SAM核开关(SAM-I至SAM-V核开关)；它们在调控细胞的甲硫氨酸生物合成中起关键作用。之前,本实验室通过RNA测序发现,十字花科黑腐病菌8004菌株(Xcc8004) XC1251基因的起始密码子前(72bp至192bp)存在一段与SAM-I核开关序列同源的序列(命名为SAM-IXcc)。本研究对SAM-IXcc是否是一个真正具有调控功能的核开关进行了鉴定。根据Xcc8004基因组测序及基因注释结果,SAM-IXcc下游是三个紧密相邻且转录方向相同的编码细菌中甲硫氨酸合成途径关键酶的基因：XC1251编码高丝氨酸O-乙酰转移酶(Homoserine O-acetyltransferase), XC1252编码合胱硫醚-γ-合酶(Cystathionine gamma-synthase), XC1253编码高丝氨酸脱氢酶(Homoserine dehydrogenase)。RT-PCR结果证明,XC1251、 XC1252、XC1253共转录,因此XC1251-XC1252-XC1253是一个转录单位。5’-RACE结果显示,XC1251-XC1252-XC1253的转录起始位点位于XC1251基因的起始密码子ATG前190bp处,证明SAM-IXcc位于XC1251-XC1252-XC1253转录子的5’UTR内,符合作为核开关的基本条件。对XC1251、XC1252和XC1253的突变体在基本培养基中的生长检测结果显示,这三个基因的突变体均为甲硫氨酸营养缺陷型,证明它们的编码产物确实在Xcc甲硫氨酸生物合成途径中起关键作用。这一结果预示,和其他SAM-I核开关一样,SAM-IXcc在调控Xcc甲硫氨酸生物合成中发挥作用。对XC1251-XC1252-XC1253转录单位的gusA转录融合报告菌株003H02的GUS活性检测结果显示,XC1251-XC1252-XC1253的转录受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的特异性抑制。为了证明XC1251-XC1252-XC1253的转录受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的抑制不是通过XC1251-XC1252-XC1253启动子的作用,本研究将XC1251-XC1252-XC1253的5’UTR区连接在带有SD序列的gusA基因的编码序列前面,然后再连接到表达载体pLARF3的Lac启动子后面,获得gusA翻译融合报告质粒,将其导入Xcc8004后获得gus报告菌株。GUS活性检测结果显示,报告菌株的GUS活性受甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的强烈抑制。由于Lac启动子在Xcc中是组成型启动子,因此,感受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸并抑制gusA表达的顺式作用元件必定存在于XC1251-XC1252-XC1253的5’UTR序列中。由于在构建的gusA翻译融合报告质粒中,连接在gusA基因前面的序列除了SAM-IXcc核开关外,还有其他序列,为了证明感受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸并抑制gusA表达的顺式作用元件是SAM-IXcc,本研究将报告质粒中SAM-IXcc核开关可能的感受(结合)S-腺苷甲硫氨酸的核苷酸进行了定点突变。GUS活性检测结果显示,携带SAM-IXcc核开关点突变报告质粒的Xcc8004菌株在添加甲硫氨酸的基本培养基中检测到的GUS活性比携带野生型SAM-IXcc核开关报告质粒的菌株的GUS活性显著增强。说明SAM-IXcc突变导致其对甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的响应迟钝,证明报告质粒中感受甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸并抑制gusA表达的顺式作用元件就是SAM-IXcc核开关。总之,以上结果证明：存在于Xcc8004基因组XC1251基因的起始密码子前72bp至192bp处的一段与SAM-Ⅰ核开关同源的序列,SAM-IXcc,是一个具有调控功能的Ⅰ型SAM核开关。它通过感受细胞中S-腺苷甲硫氨酸浓度来调节甲硫氨酸合成途径关键酶基因的表达,从而达到对细胞甲硫氨酸合成途径的调控。据悉,这是植物病原细菌中第一个被证实的有调控功能的核开关。此外,本研究结果还预示,SAM-IXcc核开关调控XC1251-XC1252-XC1253转录的机制与目前已知的SAM-I核开关的调控机制有所不同。但是,SAM-IXcc核开关调控XC1251-XC1252-XC1253转录的确切机制还有待进一步研究。