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动脉粥样硬化(AS)的形成是一个十分复杂的过程,包括内皮损伤、炎症反应、脂质沉积等诸多方面,其中VSMCs分泌的细胞外基质成分尤其是胶原的增加是一个重要的病理改变,因此,对胶原进行研究有利于了解AS形成机制,并可探讨某些药物抗AS的作用机理,为临床用药提供理论依据。但是,粥样斑块一旦形成,胶原蛋白又是维持粥样斑块稳定性的重要因素,减少其分解可以增加粥样斑块的稳定性,减少急性冠脉事件的发生。一些炎症因子(OX-LDL、T淋巴细胞分泌的因子如IFN-γ等)促使单核-巨噬细胞和VSMC分泌基质金属蛋白酶分解纤维帽中的胶原,使纤维帽变薄,因此,抑制炎症反应,减少基质金属蛋白酶的分泌和活性应该是许多有效治疗的作用靶点。以前有关胶原的研究多集中于器官纤维化方面,对血管壁的研究报道很少。本课题设计了一系列实验,试图揭示AS的部分分子调控机理,从转录水平阐明一些药物和细胞因子对胶原基因启动子活性的影响,并通过研究某些药物对基质金属蛋白酶活性的影响,了解其对粥样斑块稳定性的影响。其中重点讨论了HMG-COA还原酶抑制剂普伐他汀对胶原的作用,了解其降脂外效应。具体内容和结果如下:1.不同年龄动脉中胶原含量及成分的变化选用不同年龄(25~62岁)意外死亡尸检新鲜标本中的胸主动脉,甲醛固定,石蜡包埋切片,做常规HE和胶原、弹力纤维双重组合染色,并行Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学实验,结果发现随着年龄的增长,动脉壁中胶原纤维的含量增高,且以Ⅰ型胶原增加明显。2.药物对VSMCs增殖及细胞周期的影响 SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞(VSMCs)原代体外培养,分别加入以下<WP=6>药物和细胞因子与细胞共同培养,普伐他汀(10-6~10-2M)、OX-LDL(50ug~200ug)、普伐他汀(10-3M)+OX-LDL(50ug~200ug),分别于24h、48h和72h采用MTT方法测细胞增殖,观察不同浓度及作用时间对VSMCs增殖的影响。不同浓度的普伐他汀与VSMCs共同培养24h后,用流式细胞仪测细胞周期,观察其对VSMCs凋亡的影响。结果显示不同浓度的普伐他汀对VSMCs增殖无明显影响,而OX-LDL却可促进VSMCs增殖,且呈浓度和时间依赖性。普伐他汀和OX-LDL共同作用时可以抑制OX-LDL的促增殖效应。流式细胞仪检测低于G0/G1期DNA含量的细胞为凋亡细胞,结果显示普伐他汀可以使凋亡峰增高,有剂量依赖性。3.人α2(Ⅰ)型胶原基因启动子质粒构建及活性测定 人皮肤成纤维细胞原代、传代培养。以正常献血员全血基因组DNA(Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit)为模板PCR扩增5个有相同3’端的片段为启动子,长度分别为0.2kb、0.4kb、0.7kb、1.6kb和2.4kb,与不含启动子,但含有SV40增强子、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因载体质粒pCAT3-Enhancer(promega)构建5个重组体pCOLH20.2、pCOLH20.4、pCOLH 20.7、pCOLH 21.6、pCOLH22.4,其中所含的启动子分别相应于人α2(Ⅰ) 胶原基因上游-129~+58、-339~+58bp、-616~+58bp、-1476~+58bp、-2292~+58bp 序列,DNA转染采用FuGENE 6瞬时转染法(Roche),同时转染β–gal表达质粒pSVβ-gal(promega)作内对照及含CAT的表达质粒(invitrogen)作阳性对照。继续培养24h,测报告基因CAT活性。结果表明转染pCOLH22.4、pCOLH21.6重组体的细胞具有较高CAT表达量,pCOLH20.4、pCOLH20.7表达量次之,而pCOLH20.2 CAT表达活性极低。若以pCOLH22.4的CAT表达量为1,其余重组体的CAT相对表达量分别为0.1±0.03(pCOLH20.2)、0.89±0.09(pCOLH20.4)、0.85±0.12(pCOLH20.7)、0.94±0.06(pCOLH21.6)。4.药物及细胞因子对人I型胶原α2(I)链启动子活性的调控大鼠胸主动脉VSMCs体外培养,选取报告基因活性较高的pCOLH22.4及<WP=7>pCOLH21.6作为研究对象,FuGENE 6 瞬时转染法(Roche)将2ug pCOLH22.4 和pCOLH21.6转染入VSMCs,48小时后测CAT的活性,不加药为空白对照,实验组在24h时加入普伐他汀10-2M、10-3M、10-4M、IFN-γ100u/ml、TGF-β1 1ng/ ml、AngⅡ10-7M,所有实验重复三次,每次两复孔。以未加入任何细胞因子或药物孔的CAT值为1,实验孔与之比值作为实验孔CAT的相对表达量。结果表明与对照组相比,普伐他汀和IFN-γ能够明显抑制CAT的活性表达,CAT活性分别为对照组的0.58和0.55倍(pCOLH22.4)以及0.60和0.56倍(pCOLH21.6),即能够抑制人I型胶原α2(I)链基因启动子的活性,在转录水平抑制α2(I)型胶原的表达。而TGF-β1和AngⅡ则明显增强启动子的活性,与对照组相比,活性分别增加了2.78和1.775倍(pCOLH22.4)以及2.5和1.76倍(pCOLH21.6)。普伐他汀中以10-3M作用最强,但不同浓度之间无统计学差异。5.药物及细胞因子对基质金属蛋白酶活性的影响大鼠腹腔巨噬细胞分离培养,与不同浓度的普伐他汀(10-4M、10-3M、10-2M)以及OX-LDL(50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)共同培养,分别在24h、48h、72h收集上清液。灌制含0.1%明胶为底物的SDS-PAGE凝胶,4℃情况下电泳,Triton-X100振荡30分钟,底物缓冲液浸泡过夜,考马斯亮蓝染色,脱色液脱色后可在蓝色的凝胶背景上出现白色透明条带,根据条带的灰度值可反映MMPs的活性大小。实验结果发?