相思子毒素(abrin)与蓖麻毒素(ricin)均为毒性很强的植物源性蛋白毒素,它们在分子结构和功能上极其相似,分子结构上它们均属于A/B链结构,借助一个二硫键连接,其中A链是毒性链,其能在B链的介导下进入真核细胞来阻断其核糖体上的蛋白质合成,从而导致细胞死亡;B链无毒,主要功能是与真核细胞表面的半乳糖残基特异性的结合。两种毒素对小鼠的半数致死剂量(LD50)均为纳克级别。植物毒素与病原微生物相比虽然没有传染性,但其来源更为广泛且易获得,特别是蓖麻作为经济作物在各地有大量种植,且毒素的制备过程简单,国际社会早已将其列为B类生物管控物质,在美国等西方国家常有关于两种毒素的恐怖事件发生,其对我国社会公共安全也同样有着不容忽视的潜在威胁。针对这两种毒素检测的研究已取得了部分成绩,并推出多种检测试剂,但是作为防治方面的疫苗研究还一直处于实验室和临床研究阶段。因此,研究与制备针对两种毒素的医学预防疫苗就具有十分重要的军事和社会意义。在此类结构的毒素中,A链的免疫原性通常要明显好于B链,但是A链具有毒性,不能直接用作疫苗,因此本研究是基于这两种毒素的A链,对其进行各种减毒的改造(包括截短和定点突变),然后通过大肠杆菌表达系统对改造好的基因进行重组蛋白的表达,经亲和纯化得到数个重组候选疫苗抗原,通过以下实验对它们进行一系列的筛选,这些实验包括:毒性检测、免疫动物及保护效果的测定等,最终筛选出毒性低且免疫原性高的最优候选疫苗抗原,为疫苗进入临床实验奠定基础。对于abrin疫苗研究而言,以实验室保存的abrin A链基因为模板,采用PCR方法设计5对不同的引物并扩增出5条相互含有重叠序列的截短片段,将扩增的5个基因片段构建相应的原核表达载体,并进行蛋白可溶性表达实验条件的优化,优化后发现5个重组的截短A链蛋白(t ATA1-5:truncated ATA)里只有t ATA1和t ATA4两个蛋白能得到可溶性表达,由于考虑到包涵体蛋白纯化过程的繁琐以及包涵体蛋白经变复性后天然构象可能发生改变,因此选取这两个可溶性蛋白用于下一步实验,利用重组蛋白带有6×His标签的特性,采用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,对纯化后的A链截短片段重组蛋白进行Western blotting实验,分析其抗原性,并对其进行体内外的毒性测定实验,蛋白t ATA1和t ATA4再分别与不同佐剂混合免疫小鼠,共免三次,次间间隔三周,每次免疫后一周取小鼠尾静脉血并分离血清,用ELISA法对其进行抗体滴度的测定,小鼠末次免疫一周后,用abrin分别以腹腔注射或呼吸道气溶胶喷雾两种途径对其攻毒,攻毒后的小鼠每隔24 h观察并记录其体重至攻毒后10天,分析得出不同组的小鼠生存率,最后发现t ATA4免疫后的小鼠对abrin的抵抗效果明显好于t ATA1免疫后的小鼠,因此选取t ATA4用于下一步的被动保护实验,将经过蛋白t ATA4三次免疫后小鼠的血清与不同剂量的毒素在体外混合孵育后,经腹腔注入未接受任何处理过的小鼠体内,每隔24 h记录小鼠存活状态直至攻毒后10天,计算不同组小鼠的生存率,分析其被动保护的最高剂量。对于ricin疫苗研究而言,第一步通过定点突变技术对ricin A链上几个关键的毒性位点进行了定点突变,第二步设计引物将A链序列C末端的第199-267位氨基酸进行截除,截除后的基因片段按同样的方法借助原核表达系统对其进行表达和纯化,重组蛋白命名为mt RTA(mutated and truncated RTA),后续实验方法同t ATA4后续实验方法;对于研究同时针对abrin和ricin两种毒素的二联疫苗而言,主要是基于已筛选出来的t ATA4和mt RTA两个候选抗原,分为两种形式:一是以嵌合表达形式的二联疫苗记为“mt RTA-t ATA4”,二是以物理混合形式的二联疫苗记为“mt RTA+t ATA4”,借助原核表达系统对重组蛋白进行表达和纯化,再按同样的方法对纯化好的抗原蛋白进行Western blotting实验、体内外毒性实验、小鼠的免疫与攻毒保护实验、小鼠的被动保护实验等一系列实验。经过PCR、双酶切与测序验证,构建的含有不同目的基因的原核表达载体均与预期结果完全一致,蛋白t ATA4的基因序列全长564 bp,共编码188个氨基酸,蛋白mt RTA的基因序列全长594bp,共编码198个氨基酸,重组蛋白t ATA4与mt RTA的相对分子质量均约为22k Da,其在大肠杆菌中经培养条件优化后能以上清和包涵体沉淀两种形式表达,将上清中可溶性形式表达的蛋白液经镍离子亲和层析柱纯化后,进行Western blotting实验证实这两种蛋白均具有良好的抗原性,体内外毒性实验发现,经改造后的A链重组蛋白的毒性较天然毒素和未改造的A链重组蛋白已大大降低,即使单次注射剂量达到1mg时(相当于正常单次免疫剂量10μg的100倍),小鼠也没产生明显的不适症状。将重组蛋白分别与铝佐剂或SPO1佐剂混合后免疫小鼠,经过免疫后的小鼠血清中可检测到特异性的Ig G抗体,且在三免后小鼠血清抗体效价均可达到1:106,攻毒实验分别采取两种途径:腹腔注射攻毒与呼吸道气溶胶喷雾攻毒。经t ATA4免疫后的小鼠对abrin经腹腔或呼吸道途径攻毒的最高完全抵抗剂量分别为40或30×LD50,同时将经过完整免疫后小鼠的血清与不同剂量但相同体积(250μL)的abrin在体外混合,再对未经任何处理的小鼠进行腹腔注射的被动攻毒,结果显示免疫血清能完全保护未经免疫的小鼠抵抗20×LD50的abrin腹腔攻毒。经mt RTA免疫后的小鼠对ricin经腹腔或呼吸道途径攻毒的最高完全抵抗剂量分别为40或20×LD50,同时将经过完整免疫后的小鼠血清按上述方法进行小鼠的被动保护实验,结果显示免疫血清能完全保护未经免疫的小鼠抵抗25×LD50的ricin腹腔攻毒。对于二联疫苗而言,小鼠的免疫与攻毒实验证实,以物理混合形式的二联疫苗效果明显好于以嵌合表达形式的二联疫苗,经“mt RTA+t ATA4”免疫后的小鼠能完全抵抗ricin或abrin的剂量分别为10或20×LD50,对于两种毒素混合攻毒的最高抵抗剂量为10×LD50。本研究成功的设计、构建、表达和筛选了重组蛋白候选疫苗抗原t ATA4和mt RTA,实现了这两种蛋白在原核系统中的可溶性表达。通过抗原性及体内外毒性实验的验证发现,所获得的候选疫苗抗原具有良好的抗原性,以及对实验细胞和动物的低毒或无毒性,同时小鼠的免疫与攻毒实验也证实这两种疫苗候选抗原具有良好的免疫刺激作用和免疫保护效果,以上结果为abrin和ricin疫苗下一步的临床实验做好了准备。