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【研究背景】牙周炎导致的牙槽骨吸收和丧失是成人牙齿缺失的首要原因,如何抑制炎症环境中骨组织的吸收也是临床牙周治疗面临的重要挑战。在牙周炎的病理过程中,不同极化状态的CD4+T细胞通过其产生的炎性因子调节宿主免疫反应,在牙周炎的发生发展过程中发挥了重要的作用。研究发现,RANKL-OPG系统介导的骨免疫过程,在骨组织损伤、修复以及改建的过程中发挥了重要作用。牙周炎症环境中,CD4+T细胞极化对RANKL-OPG系统的调节机制仍不清楚,是否能够通过调节CD4+T细胞极化来缓解牙周炎症环境中的炎症反应、抑制骨吸收也有待于进一步研究。骨化三醇(Calcitriol)是维生素D3最重要的代谢产物之一,能通调节钙、磷的代谢影响骨组织代谢,同时在免疫调节方面,骨化三醇也能够通过多种途径抑制组织内的炎症反应。因此,骨化三醇骨有望成为牙周炎的治疗药物。本实验在明确了CD4+T细胞极化与RANKL-OPG系统相关性的基础上,进一步探究了CD4+T细胞极化与RANKLOPG系统之间的作用关系,并通过体外、体内实验探究牙周炎症环境中骨化三醇对CD4+T细胞极化及骨损伤的调节作用,旨在为牙周炎治疗提供新的思路。【研究目的】1.以临床牙周炎患者为研究对象,分析牙周炎患者牙龈组织中CD4+T细胞极化与RANKL/OPG比率的关系,并探讨牙周基础治疗对龈沟液中RANKL/OPG比率与CD4+T细胞极化关系的影响——明确牙周炎症环境中,牙龈组织和龈沟液中CD4+T细胞极化与RANKL/OPG比率的相关性。2.以小鼠脾脏来源的CD4+T细胞为研究对象,分析炎性刺激对CD4+T细胞极化及其RANKL表达水平的影响——明确CD4+T细胞极化与RANKL表达水平的关系。3.以小鼠脾脏来源的CD4+T细胞为研究对象,分析骨化三醇干预对炎性环境中CD4+T细胞极化及其RANKL表达水平的影响——明确骨化三醇对炎性环境中CD4+T极化的调节作用及其对细胞RANKL表达水平的影响。4.以大鼠牙周炎模型为研究对象,分析骨化三醇灌喂对牙周炎建模过程中的骨吸收和对CD4+T细胞极化的调节作用——明确骨化三醇对牙周骨吸收的抑制作用及其对CD4+T细胞极化的调节作用。【研究方法】1.分别收集牙周炎患者和健康志愿者的龈沟液、牙龈组织,通过ELISA实验(酶联免疫吸附实验)、免疫组化等方法,分析CD4+T细胞极化相关炎性因子在龈沟液和牙龈组织中的表达水平;通过免疫荧光观察牙龈组织中CD4+T细胞极化情况,通过免疫组化观察牙龈组织中RANKL、OPG表达水平,进一步利用线性回归分析方法确立CD4+T细胞极化与RANKL/OPG比率的相关性。2.根据纳入标准和排除标准确定研究对象,分别按照牙周炎患者和健康志愿者两组,收集人口学信息、牙周临床参数(基线)和龈沟液(基线);牙周炎患者组接受牙周基础治疗(健康志愿者为对照),治疗后第2、4、6个月复诊,测量牙周临床参数并收集各个时间点龈沟液,ELISA分析龈沟液中RANKL、OPG及CD4+T相关炎性因子的表达,并利用线性回归分析方法确立CD4+T相关炎性因子表达水平与RANKL/OPG比率的关系。3.分离培养小鼠脾脏来源CD4+T细胞和DC细胞,设立体外CD4+T细胞炎性刺激模型(与DC细胞共培养并加入炎性因子LPS)和对照(正常培养条件),流式细胞术检测炎性刺激后共培养体系中CD4+T细胞极化状态;PCR、Western blot检测炎性刺激后,共培养体系中CD4+T细胞极化相关转录因子、炎性因子和RANKL水平;进一步,上述共培养体系刺激后的CD4+T细胞与RAW264.7细胞共培养,TRAP染色观察RAW264.7细胞破骨活性,PCR技术、Western blot检测RAW264.7细胞、NFATC1和MMP-9的表达水平。4.骨化三醇加入体外CD4+T细胞炎性刺激模型(与炎性因子LPS同时加入),观察骨化三醇干预对炎性刺激模型中CD4+T细胞极化的影响(流式细胞术、PCR和Western blot);共培养体系刺激后的CD4+T细胞与RAW264.7细胞共培养,进一步分析骨化三醇干预后CD4+T细胞对RAW264.7破骨活性的影响。5.30只SD大鼠随机分成3组(对照组、牙周炎组和骨化三醇干预牙周炎组;每组10只)。建模4周后取材分析牙槽骨破坏水平(micro-CT),炎症细胞浸润水平(HE染色)和破骨细胞活性(HE染色、TRAP染色),进一步通过免疫组化方法分析组织内RANKL、OPG和CD4+T细胞极化相关炎性因子的表达水平,通过流式细胞术分析大鼠外周血CD4+T细胞的极化水平。【研究结果】1.牙周炎患者牙龈组织中CD4+T细胞极化水平与RANKL/OPG比率密切相关本实验共收集到57份牙龈组织和龈沟液样本(牙周炎组35例、牙周健康组22例);CD4+T细胞极化相关的炎性因子检测结果显示,牙周炎组IL-4、IL-10表达水平明显低于牙周健康组(p<0.05),而IL-17表达水平则高于牙周健康组(p<0.05),其趋势在龈沟液和牙龈组织中基本一致;牙龈组织免疫荧光染色发现,牙周炎组Th1、Th17细胞数目明显高于牙周健康组(p<0.05),而Th2、Treg细胞数目明显低于牙周健康组(p<0.05);尽管OPG在两组牙龈组织中的表达水平无显著性差异(p>0.05),但牙周炎组RANKL的表达水平、RANKL/OPG比率均明显高于牙周健康组(p<0.05);线性回归分析结果显示,牙周炎组中RANKL/OPG比率与Th1、Th17极化呈正相关(r=0.71,r=0.75)、与Th2极化呈负相关(r=-0.48)。2.牙周治疗对龈沟液反映的RANKL/OPG比率和CD4+T细胞极化关系的影响根据纳入标准和排除标准确定22例牙周健康志愿者和21例牙周炎患者为研究对象。牙周基础治疗后,牙周炎患者的牙周临床参数均得到明显改善;龈沟液ELISA检测结果发现,牙周治疗后RANKL/OPG比率降低(p<0.01;提示破骨活动减弱),同时IFN-γ、IL-17表达水平降低(p<0.05),而IL-4、IL-10表达水平升高(p<0.01)。然而线性回归分析结果表明牙周基础治疗后,RANKL/OPG比率与IL-4、IL-17仍然存在线性关系(p<0.05)。3.体外CD4+T细胞炎性刺激对CD4+T细胞极化及其破骨诱导活性的影响免疫磁珠分选试剂盒成功分选CD4+T细胞及DC细胞,体外炎性刺激模型中(CD4+T细胞与DC细胞共培养并加入炎性因子LPS),CD4+T细胞Th2极化减弱(p<0.01)、Th17极化增强(p<0.01),从而导致Th2/Th17比率降低;与此同时,Th2极化相关转录因子GATA3、STAT5和细胞因子IL-4表达水平降低(p<0.01),而Th17极化相关转录因子RORγT、STAT3和炎性因子IL-17表达水平上升(p<0.01);此外,体外CD4+T细胞炎性刺激模型中CD4+T细胞高表达RANKL,并能明显促进RAW264.7细胞的破骨活性。4.骨化三醇对炎性刺激模型中CD4+T细胞极化及其破骨诱导活性的影响骨化三醇加入体外CD4+T细胞炎性刺激模型(与炎性因子LPS同时加入)后,CD4+T细胞Th2极化上调(p<0.01),Th17极化下调(p<0.01),Th2/Th17比率上调(p<0.01);与此同时,Th2极化相关转录因子、炎性因子上调(p<0.01),Th17极化相关转录因子、炎性因子下调(p<0.01);此外,骨化三醇干预明显降低共培养体系中CD4+T细胞RANKL表达水平(p<0.01),并能抑制RAW264.7细胞的破骨活性。5.骨化三醇干预对牙周炎建模过程中骨吸收和CD4+T细胞极化的影响建模4周后micro-CT结果显示,骨化三醇干预明显减少牙周炎建模过程中牙槽骨吸收;与此同时,炎症细胞和破骨细胞浸润数目减少(p<0.05);免疫组化分析结果表明,局部牙周组织中,RANKL表达水平降低(p<0.05)、OPG表达水平上升(p<0.05)、RANKL/OPG比率下降(p<0.01)、IL-4表达水平上升(p<0.01),IL-17表达水平下降(p<0.01);大鼠外周血检测结果表明,骨化三醇干预明显增加Th2、Treg极化的CD4+T细胞(p<0.01),而减少Th1、Th17极化的CD4+T细胞(p<0.05)。【研究结论】CD4+T细胞极化在牙周炎发生发展和转归中起十分重要的作用,牙周炎症状态影响和调节CD4+T细胞极化,极化的CD4+T细胞本身及其分泌的相关因子对RANKL-OPG系统的影响可能是CD4+T细胞影响牙周骨吸收的主要原因。CD4+T细胞极化调节的药物(例如骨化三醇)干预有望成为牙周免疫治疗的新方法,值得进一步深入研究。