论文部分内容阅读
近年来,国内外许多学者相继报道了一类危害较为严重,可特定定殖于宿主肠道外的其他组织,并严重致病的一类新的大肠杆菌菌群——肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinalpathogenic Escherichia coli,ExPEC)。ExPEC能引起人和动物肠外组织感染,可致使不同宿主发生脑膜炎、败血症、泌尿道感染和呼吸道感染。该病每年给全球公共医疗业及畜牧业造成巨大的财政支出,已引起全世界的广泛关注。肠外致病大肠杆菌以具有能引起肠外感染的特异性毒力因子为特征。其中菌毛是位于其菌体表面,与细胞运动、生物膜形成、粘附、致病因子释放等相关的一种蛋白质结构,作为重要的药物靶目标为国内外学者所关注。因此,研究编码Ⅰ型菌毛主体蛋白亚基的fimA基因具有重要意义。本试验从吉林某猪场采集了患有肺炎的猪肺、脑、心等组织。通过鉴别培养基及16SrDNA PCR鉴定,确定从其肺脏分离的菌株为大肠杆菌。经小鼠毒力试验、回归动物试验证实分离菌株毒力强,并能够独立引起猪肺感染导致死亡。从而将此菌株定性为肠外致病性大肠杆菌,命名为SLPE。通过微量稀释法进行其对8种抗菌药物的耐药性检测,结果显示SLPE具有多重耐药性,仅对β-内酰胺类药物敏感。为进一步阐明其致病机理及多重耐药机制,本试验对SLPE菌株的全基因组进行测序分析。筛选出66个与菌毛相关的基因及35个耐药基因(外排调控基因MarC,外排泵MATE基因,耐药基因移动原件IS,四环素耐药基因tet,氟苯尼考耐药基因FloR等)。利用生物信息学软件对ORF890号基因编码的氨基酸序列分析结果进一步证明了此DNA片段是fimA基因。在此基础上,以SLPE基因组为模板,对ORF890fimA基因进行PCR扩增、T-A克隆,原核表达重组质粒pET-28a-fimA、pET-32a-fimA构建,经IPTG诱导pET-32a-fimA-BL21表达得到了约38.7ku的蛋白。上述研究结果为FimA抗体的制备及建立有效的该基因表达水平检测方法奠定基础,并在一定程度上阐明ExPEC的致病机制。