研究背景：Hedgehog信号通路在调控细胞生长、分化和肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。在生殖细胞中Hh信号转导通路的异常激活往往造成发育过程紊乱；在体细胞中Hh信号转导通路的异常活化则往往伴随多种癌症的发生。肿瘤是在遗传因素和环境因素的共同作用下，细胞周期紊乱和细胞生长失控所致的一类疾病。大量研究表明：肿瘤发生的关键在于肿瘤相关基因的转录失控。某些蛋白作为反式作用因子（trans acting factors）与其他基因的顺式作用元件（cis actingelements）相互作用，实现对肿瘤相关基因转录水平的调控。因此，深入研究肿瘤相关基因的反式作用因子有助于我们了解肿瘤相关基因的表达调控机制。转录因子GLI（Glioma-associated oncogene transcription factors, GLI）位于Hh信号通路级联传导的末端，是通路上的关键调控因子，在信号传导中起枢纽作用。研究表明GLI功能异常可能参与多种肿瘤发生发展，但调控机制有待明晰。有研究报道抑制GLI能降低神经胶质瘤细胞增殖与侵袭能力，基因芯片结果也证实GLI抑制的癌细胞中microRNAs的表达发生类似改变，提示受其调控的microRNAs在神经胶质瘤形成及发展过程中可能发挥重要作用。研究目的：1.本课题以GLI为研究靶标，根据生物信息学方法预测具有GLI结合元件的microRNAs，结合基因芯片数据，采用实时定量PCR及Western Blot等手段，证明miR-124为受GLI调控的microRNA，并确定AURKA为其下游靶基因，从而建立“GLI/miR-124/AURKA”信号轴。2.研究与神经胶质瘤密切相关的microRNAs，特别是miR-124的功能，从分子、细胞和临床水平三个层面分别验证“GLI/miR-124/AURKA”信号轴的正确性，揭示“GLI/miR-124/AURKA”信号轴与神经胶质瘤的关系，丰富Hh-GLI信号网络的调控机制，为寻找神经胶质瘤诊疗新靶点提供理论依据。研究内容：1.前期研究中，我们发现在GANT61处理的神经胶质瘤细胞中许多重要信号通路相关基因的表达发生显著改变，利用生物信息学方法对在GLI抑制条件下的差异表达基因进行GLI结合位点预测分析，发现存在一定数量的差异表达基因不含有已知的GLI蛋白转录结合区域，因此我们提出“转录因子/microRNAs/间接靶基因”的调控模型。2.利用特异性小分子抑制剂下调GLI的表达后，通过基因芯片技术分析microRNAs表达谱变化；同时用生物信息学方法对差异表达的microRNAs进行归类分析；采用实时定量PCR技术对富集于某些信号通路的差异microRNAs进行验证。通过分析microRNAs表达谱芯片发现，经GANT61处理后的神经胶质瘤细胞系中，miR-519a、miR-335和miR-124等microRNAs表达水平升高，经过多重验证后，我们优先选取miR-124进行后续的功能研究。3.采用多个数据库（TargetScan算法、基于序列互补的miRanda、基于热力学模型的PicTar）预测，结合基因芯片差异表达谱结果分析，选定AURKA作为miR-124的下游靶基因，电转染法高表达miR-124后检测下游靶基因的变化（包括mRNA水平和蛋白水平等方面），对受microRNAs调控的靶基因进行验证。4.在H4细胞中，通过GLI的特异性抑制剂GANT61处理、干扰质粒下调GLI2和高表达miR-124等手段，检测相应组分的mRNA水平及蛋白水平的变化情况，验证并确立“GLI/miR-124/AURKA”信号轴的正确性，采用流式细胞仪检测信号轴对细胞周期的影响。5.在临床样本水平上，通过免疫组化法以及Western Blot法检测GLI2与AURKA的表达水平，分析二者相关性，揭示出“GLI/miR-124/AURKA”信号轴在神经胶质瘤发生发展中的临床意义。研究结果：1. Hedgehog信号通路中存在“GLI/miR-124/AURKA”信号轴。2.“GLI/miR-124/AURKA”信号轴的调控节点为GLI2，并在临床样本水平上发现GLI2与AURKA的表达存在相关性。3.“GLI/miR-124/AURKA”信号轴能够通过影响神经胶质瘤细胞周期调控肿瘤细胞的生长。