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禽白血病是由C型反转录病毒科中禽白血病病毒引起的禽类肿瘤性传染性疾病。自1988年J亚群禽白血病病毒(ALV-J)首次在英国被鉴定后，ALV-J快速扩散至其他国家及地区。该病临床上主要表现为多种肿瘤性病变，同时导致鸡的体重增长速度下降、鸡群的产蛋率降低、免疫抑制及免疫失败，给养禽行业带来巨大经济损失。而ALV-J是内源性禽白血病病毒与外源性禽白血病病毒整合而成的重组病毒，不但引起肉鸡发生髓细胞瘤以及其它恶性肿瘤，还能引起蛋鸡的肿瘤性疾病，是近几年危害最为严重的鸡病之一。我国农业部对种禽场提出了净化禽白血病的要求，希望通过病原和抗体的检测淘汰阳性鸡，最终达到净化效果。目前用于禽白血病病原检测的有P27的ELISA试剂盒，但检测J亚群抗体试剂盒不稳定，非特异现象严重，亟需建立一种比较特异而有效的方法来检测抗体，并用以J亚群禽白血病净化的评估。 1、ALV-J特异性单克隆抗体JE9抗原表位的鉴定 本研究在获得抗ALV-J特异性单克隆抗体JE9的基础上，对其识别的抗原表位进行了鉴定。首先将含有ALV-J特异性单克隆抗体JE9抗原表位的序列分三段(ALV-J-1P/2P/3P)进行抗原多肽合成，通过间接ELISA方法进行了鉴定，结果显示ALV-J-3P与ALV-J单抗反应。利用表位作图法，通过固相合成技术合成多肽，然后以ELISA方法将合成的多肽与J亚群特异性单抗JE9进行反应，通过不断缩短氨基酸的个数，最终鉴定JE9所识别的抗原表位为WDPQEL。分析发现这一抗原表位是目前已知的所有ALV-J亚群毒株的共同表位。 2、检测ALV-J抗体的特异性多肽的筛选及ELISA方法的建立 本研究中，我们通过生物信息学原理，应用计算机软件DNAStar对ALV-J囊膜蛋白gp85段氨基酸的二级结构、可及性、亲水性、可塑性等进行综合分析，选取五段序列(ALV-J-1P/2P/3P/4P/5P)进行抗原多肽合成，通过间接ELISA方法，用已知J亚群多抗血清进行了鉴定，结果显示所有多肽均能与ALV-J多抗血清反应，但反应性有所差异，其中ALV-J-3P与ALV-J抗体阳性的血清反应性最佳。将ALV-J-3P分成两段(3P-1/2)进行多肽合成，再与相应的多抗血清反应，结果显示缩短后的3P-2与ALV-J-3P具有同样好的反应性。随后我们比较了多肽裸肽和偶联BSA肽与多抗血清的反应性，结果发现，偶联后的多肽作为抗原检测ALV-J抗体效果更好。 将筛选出的最佳多肽与BSA偶联，以BSA-3p-2作为包被抗原，通过控制单一变量法确定最佳的ELISA条件，包括抗原多肽包被浓度、时间和温度、封闭液及封闭时间、一抗孵育的时间、HRP标记的兔抗鸡IgG孵育时间及TMB底物显色液显色时间等。按照建立好的ELISA程序对该方法的特异性和可重复性进行了验证。交叉反应性实验证明本研究建立的多肽ELISA方法仅与ALV-J多抗血清反应，而不与抗其它禽类病毒(MDV、NDV、CAV、AIV、IBDV、IBV、ILTV和ALV-A)的多抗血清反应，说明本方法有很好的特异性。此外，该方法的批间和批内的变异系数均小于10％，表明其具有良好的重复性。 用本研究建立的ELISA方法对江苏省和山东省鸡场送检的血清样本及实验室自制血清进行了检测，240份样品中检测出阳性样本数量57份。为进一步确认检测结果的准确性，用IDEXX ELISA抗体检测试剂盒和IFA方法对检测出的阳性结果再次进行检测，结果显示57份样本中IFA能检测出49份，而IDEXX ELISA抗体检测试剂盒只能检测出14份。综上结果表明，本研究建立的间接ELISA方法较商品化试剂盒具有更高的特异性和灵敏度，从而为我国禽白血病的诊断奠定了基础。 3、不同感染途径鸡的抗原和抗体变化规律 为了解不同感染途径鸡的抗原和血清中抗体的变化规律，本研究将ALV-J JS09GY07病毒株以卵黄囊接毒、皮下接毒及口服接毒三种方式分别感染6胚龄SPF鸡胚及1日龄SPF鸡，感染后每10天采集胎粪或泄殖腔棉拭子，同时采集血液、分离血清以检测p27抗原、J亚群抗体以及p27抗体。实验结果显示，病毒血症的高峰期在10d-40d之间;并不是所有携带病毒的鸡都能够排毒，但是能够排毒的感染鸡会持续排毒;感染ALV-J后30d开始产生p27抗体，且抗体水平很高，呈波浪状变化;J亚群禽白血病病毒抗体首次产生是在20日龄，抗体水平比较低，50日龄及100日龄左右达到高峰期。本研究结果为ALV-J的防控技术措施的制定提供了重要参数。