1、研究背景乳腺癌是女性发病率最高的一种癌症。近年来,随着乳腺癌的基础研究向临床的不断转化,目前乳腺癌的治疗手段极大地改善了乳腺癌患者的治疗效果,但在乳腺癌治疗过程中,肿瘤的耐药、复发和转移现象也日益严重。包括乳腺癌在内的许多肿瘤中,存在一小群具备自我更新、多向分化潜能并能够启动和重建肿瘤组织表型的肿瘤细胞,被称为肿瘤干细胞。大量研究表明,肿瘤干细胞参与肿瘤转移、复发和放化疗耐受的过程。因此靶向肿瘤干细胞的治疗策略将有望成为癌症治疗的新方向。然而,由于肿瘤干细胞存在不同的亚群,且具备较强的可塑性和动态性,针对肿瘤干细胞的治疗仍然缺乏有效的靶点和干预机制。PDK1能够磷酸化丙酮酸脱氢酶(PDH)使其失去活性,抑制丙酮酸转化成乙酰辅酶A,从而阻止丙酮酸进入三羧酸循环。研究表明,PDK1蛋白在多种恶性肿瘤(包括乳腺癌)中异常高表达。作为一种重要的糖酵解限速酶,PDK1广泛参与了细胞的生理代谢过程,在调节肿瘤进展和干细胞重编程中具有重要作用。既往研究证实PDK1与肿瘤增殖、肿瘤转移、肿瘤放化疗抵抗以及不良预后密切相关。但是PDK1蛋白调控肿瘤发生发展的具体机制尤其与肿瘤干细胞的联系尚不明确,这一领域有待更加深入地研究和探索。更重要的是,这一研究为靶向肿瘤干细胞的乳腺癌临床治疗策略提供了新的方向。2、研究方法(1)(1)对表达谱数据GSE15192进行统计分析,比较细胞中CD44~+/CD24~-和CD44~-/CD24~+两个亚群的糖酵解限速酶的表达情况。(2)通过体外微球悬浮培养和ALDH~+细胞分选,富集乳腺癌肿瘤干细胞群,利用RT-qPCR方法,比较“干性”群体与非“干性”群体中PDK1基因及其他糖酵解限速酶的表达情况;利用Western blotting方法检测10对乳腺癌及癌旁组织标本中PDK1蛋白表达水平;分析GEO数据集的GSE3494和GSE9893 PDK1蛋白表达水平与患者整体生存率(OS)的关系。(3)通过转染siRNA或质粒,敲降或过表达PDK1,利用流式细胞术检测ALDH~+细胞群的比例;利用慢病毒载体构建稳定敲降或高表达PDK1的细胞系,通过Western blotting方法检测PDK1和干性因子的蛋白表达,并利用体外微球悬浮培养实验,检测PDK1表达变化对乳腺癌细胞微球形成能力的影响;通过裸鼠荷瘤实验检测敲降PDK1后肿瘤形成的体积变化。(4)利用BrdU染色,细胞周期分析和CCK8试剂盒检测PDK1表达变化对乳腺癌细胞增殖、细胞周期和细胞生存能力的影响。(2)(1)利用免疫荧光染色检测HIF-1α和PDK1在肿瘤中的定位,通过苏木素-伊红染色检测肿瘤标本组织形态。(2)通过免疫荧光检测肿瘤干性因子在肿瘤中央和外周的定位和表达;将肿瘤中央区和外周区的细胞进行原代培养,通过RT-qPCR实验检测两种细胞PDK1表达水平;通过裸鼠荷瘤极限稀释实验,检测两种细胞的成瘤能力;并通过微球形成实验检测两种细胞微球形成能力。(3)通过试剂盒检测肿瘤中央区和外周区原代细胞的葡萄糖摄取、乳酸生成、ATP水平和PDH活性。(4)分离NTC和shPDK1皮下肿瘤的中央区和外周区进行原代培养,检测两区域细胞在敲降PDK1后PDK1表达水平、PDH活性、糖酵解水平和微球形成能力。(3)(1)通过RT-qPCR实验,检测肿瘤中央区和周围区域细胞9种低氧相关lncRNA的表达水平,检测在低氧和常氧培养下9种低氧相关lncRNA的表达水平,检测肿瘤微球和癌细胞中9种lncRNA表达水平。(2)利用慢病毒建立稳定敲降H19的细胞系,RT-qPCR实验检测敲降效率。(3)利用试剂盒检测低氧和常氧条件下敲降H19对肿瘤细胞葡萄糖摄取,乳酸生成和ATP水平的影响。(4)利用RT-qPCR检测siH19的敲降效率;再利用Western blotting实验检测敲降H19对干性因子表达量的影响;利用微球形成实验检测细胞微球形成的大小和数量。(4)(1)利用RT-qPCR和Western blotting实验检测低氧条件下H19敲降的乳腺癌细胞PDK1蛋白和mRNA水平,并利用试剂盒检测PDH活性。(2)在敲降PDK1的细胞中过表达H19质粒,通过Western blotting实验检测PDK1的蛋白水平;利用试剂盒检测肿瘤细胞葡萄糖摄取、乳酸生成和ATP水平;通过微球形成实验,检测微球形成的大小和数量;通过裸鼠荷瘤实验检测肿瘤形成的体积变化。(3)收集20例乳腺癌病例样本,通过RT-qPCR检测H19和PDK1表达量,通过卡方检验对二者进行相关性分析。(5)(1)通过RT-qPCR和Western blotting实验,检测低氧条件下敲降H19对HIF-1α的mRNA和蛋白水平的改变。(2)利用试剂盒提取细胞核和质的RNA,通过RT-qPCR检测常氧和低氧条件下H19的表达水平;利用分子克隆技术,将HIF-1α3’UTR全长序列、预测的let-7靶向序列及靶点突变序列克隆到psiCHECK载体,通过荧光素酶报告实验,检测let-7类似物对报告载体荧光素活性的影响;通过Western blotting和RT-qPCR实验,检测let-7类似物或抑制剂对HIF-1α的mRNA和蛋白表达的影响。(3)通过荧光素酶报告实验,检测H19梯度上升对psi-HIF-1α-MRE荧光素酶活性的影响;在低氧条件下转染siH19和let-7抑制剂,通过Western blotting检测HIF-1α的蛋白表达变化。(4)利用shRNA慢病毒载体,构建稳定敲降HIF-1α的细胞,通过RT-PCR实验检测HIF-1α敲降效率和PDK1 mRNA水平;在敲降HIF-1α的细胞中高表达H19,利用Western blotting实验检测HIF-1α和PDK1蛋白表达水平。(6)(1)通过RT-qPCR实验,检测时间或剂量依赖地加入阿司匹林对H19mRNA表达水平的影响;利用Western blotting实验,检测低氧条件下阿司匹林对PDK1表达水平的改变;利用试剂盒,检测阿司匹林对PDH活力的影响。(2)通过试剂盒,检测阿斯匹林对肿瘤细胞葡萄糖摄取、乳酸生成和ATP水平的影响。(3)通过Western blotting实验,检测阿司匹林对干性因子蛋白表达的改变;通过微球形成实验,检测不同浓度阿司匹林对肿瘤微球数量和大小的影响;通过裸鼠荷瘤实验,检测阿司匹林对肿瘤生长速率和体积的影响。3、研究结果(1)(1)GSE15192分析结果表明,CD44~+/CD24~-亚群中PDK1表达水平明显高于CD44~-/CD24~+亚群。(2)PDK1和干性因子的mRNA和蛋白水平在肿瘤“干性”细胞群和肿瘤组织中显著高于“非干性”细胞群和正常组织;Kaplan-Meier生存分析结果显示PDK1蛋白高表达的乳腺癌患者整体生存率(OS)下降,差异有统计学意义。(3)体外实验结果表明,敲降或过表达PDK1减低或升高乳腺癌细胞的ALDH~+细胞群比例、PDK1和干性因子的蛋白表达以及微球形成的大小和数量;体内实验证明,敲降PDK1显著降低裸鼠荷瘤的体积。(4)敲降或过表达PDK1对肿瘤的细胞增殖、细胞周期和细胞活力没有影响。(2)(1)免疫荧光染色和苏木素-伊红染色结果显示肿瘤中央缺氧区的PDK1表达水平显著高于外周区。(2)肿瘤中央区的干性因子表达水平显著高于外周区;中央区原代肿瘤细胞的PDK1表达,成瘤能力和微球形成能力显著高于外周区原代肿瘤细胞。(3)肿瘤中央区细胞葡萄糖摄取,乳酸生成和ATP水平显著高于外周区细胞,而PDH活性低于外周区细胞。(4)不同于NTC肿瘤的中央区与外周区细胞,shPDK1肿瘤中央区与外周区细胞的PDK1表达无差异;因此,PDH活性,葡萄糖摄取、乳酸生成、ATP水平以及微球形成能力在shPDK1肿瘤中央区与外周区细胞中没有区别。(3)(1)中央区细胞、低氧处理的肿瘤细胞和肿瘤微球细胞中的H19表达水平显著高于外周区细胞、常氧下的肿瘤细胞和二维培养的肿瘤细胞,同时与其他lncRNA相比升高倍数最高。(2)稳定敲降H19的细胞H19表达量下降,低氧条件下其葡萄糖摄取、乳酸生成和ATP水平显著减少。(3)常氧条件下H19敲降对糖酵解水平没有影响。(4)低氧条件下H19敲降显著减少干性因子的表达;H19敲降的肿瘤细胞形成微球的大小和数量显著降低。(4)(1)低氧条件下敲降H19显著下调PDK1的蛋白和mRNA水平,增强PDH的活性。(2)敲降PDK1逆转H19提升的葡萄糖摄取、乳酸生成和ATP水平。(3)敲降PDK1逆转H19提高的微球形成能力和裸鼠荷瘤体积。(4)病人的肿瘤样本中H19和PDK1存在显著相关性(n=15)。(5)(1)低氧条件下敲降H19减少HIF-1α蛋白表达,但对其mRNA水平没有影响。(2)低氧条件下H19在细胞质中表达水平显著升高,细胞核中没有明显变化;let-7类似物显著降低psi-let7 4x,psi-HIF-1α-FL和psi-HIF-1α-MRE的荧光素酶活性,而psi-HIF1α-Mut荧光素酶活性没有明显变化;在let-7类似物或抑制剂减少或增加HIF-1α蛋白水平,不影响其mRNA水平。(3)野生型H19剂量依赖的提高psi-HIF1A-MRE荧光素酶的活性,但突变的H19没有作用;敲降H19减少HIF-1α蛋白表达量,而let-7抑制剂能够逆转敲降H19降低的HIF-1α蛋白表达水平。(4)敲降HIF-1α的细胞PDK1 mRNA水平显著降低;高表达H19显著升高PDK1蛋白表达量,而敲降HIF1A可逆转H19提高的PDK1蛋白表达水平;(6)(1)阿司匹林能够时间和剂量依赖地降低H19表达水平;低氧条件下阿司匹林减少PDK1蛋白的表达,提高PDH的活性。(2)阿斯匹林抑制葡萄糖摄取,乳酸生成和ATP水平。(3)阿司匹林显著降低干性因子的蛋白表达量,减少微球形成的大小和数量,抑制裸鼠荷瘤的体积。4、研究结论(1)PDK1对乳腺癌细胞的干性维持起重要作用;(2)缺氧条件下PDK1激活糖酵解增强肿瘤干细胞特性;(3)缺氧条件下诱导的H19促进糖酵解和乳腺癌肿瘤干细胞特性;(4)沉默PDK1抑制H19介导的糖酵解过程和肿瘤干细胞特性;(5)H19通过调节HIF-1α促进PDK1基因的表达;(6)阿司匹林降低H19和PDK1的表达抑制糖酵解水平和干性维持。