杉木BBM、WOX5和WOX6基因克隆与功能研究

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杉木(Cunninghamia lanceolata)具有材质优良,生长速度快等优点,是我国南方的主要造林树种之一。近十几年来,植物体胚发生等植株再生的分子调控机制研究取得了一些重要突破,Baby Boom(BBM)和WUSCHEL(WUS)等重要基因被鉴定出来,并被逐步用于植物的体胚发生和遗传转化。然而,在杉木等裸子植物中,这些重要基因的功能和调控机制均不明确。本研究基于杉木全长转录组数据,利用生物信息学方法对杉木AP2/ERF基因家族和WOX基因家族进行了鉴定,并克隆获得了ClBBM、ClWOX5、ClWOX6基因;分析了这些基因在种胚不同发育阶段、愈伤形成、以及不定根形成过程中的表达模式;同时通过异源转化拟南芥、烟草和杨树,对其功能进行了研究,为深入解析ClBBM、ClWOX5、ClWOX6基因调控体胚和不定根形成的机制提供了重要基础。主要研究结果如下:1.基于杉木全长转录组数据,鉴定获得95个AP2/ERF家族基因,其中11个属于AP2亚家族,4个属于RAV亚家族,34个属于DREB亚家族,45个属于ERF亚家族以及1个Soloist,且该家族大多数成员的表达具有较强的组织特异性。进一步通过系统进化分析和多序列比较,鉴定获得杉木的BBM同源基因,序列分析显示该基因具有重要的特征性基序。2.基于杉木全长转录组数据,鉴定获得6个杉木WOX基因,其中ClWOX1-4属于古老进化支,ClWOX5和ClWOX6属于现代进化支,与WUS具有较近的同源关系。表达的组织特异性分析结果显示,ClWOX2在所有组织中的表达量均极低,而其它基因的表达均呈现出较强的组织特异性,如ClWOX3在根和木质部的表达水平较高,ClWOX5在茎里的表达高于其他器官。3.基于序列分析的结果,克隆获得了杉木的BBM、WOX5和WOX6基因。进一步的表达模式分析结果显示,ClBBM主要在种胚发育的前期表达高,ClWOX5在种胚发育的中期表达水平较高,ClWOX6在种胚发育后期表达量高;在愈伤形成过程中,ClBBM、ClWOX5和ClWOX6的表达受到2,4-D的诱导;而在不定根形成过程中,ClBBM的表达逐渐上调且受到生长素诱导,ClWOX5和ClWOX6在不定根形成的早(中)期表达水平较高但其表达会被生长素处理抑制。此外,ClBBM主要根尖部位表达,ClWOX5和ClWOX6则主要在根的中部和末端表达。这些结果暗示,在种胚发育和不定根形成过程中ClBBM与ClWOX5、ClWOX6发挥了不同的作用。4.以模式植物为材料,通过农杆菌侵染的方法,对ClBBM、ClWOX5和ClWOX6基因的功能进行了研究。结果表明,ClBBM的过量表达可以促进拟南芥植株提前抽薹、结实率降低并且根系变长;ClWOX5和ClWOX6转基因拟南芥植株也出现了提前抽薹和结实率降低的表型。ClWOX5和ClWOX6可以促进烟草叶片芽的分化,提高再生效率,但ClBBM转基因没有明显促进烟草叶片芽的分化。此外,在不添加外源激素的情况下,ClBBM可以促进了杨树(84K)叶片产生更多的不定根。这些结果进一步说明,ClBBM与ClWOX5、ClWOX6可能在种胚发育中均具有重要功能,但扮演了不同的角色,ClWOX5和ClWOX6具有在基因工程上应用的潜力;而ClBBM对于不定根的形成(启动)具有更重要的作用。
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