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粪链球菌又叫粪肠球菌。肠球菌是人、动物肠道的正常菌群,异位寄生时可引起败血症、尿路感染、呼吸道感染、心内膜炎、脑膜炎和伤口感染等。近年来,由于免疫抑制剂的广泛应用,侵人性治疗机会的增加,过量使用氟喹诺酮类和口服头孢菌素类药物,使肠球菌所致感染不断增加,已成为医院感染的主要致病菌。由于抗生素广泛应用,耐药菌株不断出现,肠球菌先后对链霉素和庆大霉素形成了很强的抵抗力,尤其近年来氨基糖苷类高水平耐药(HLAR)和耐万古霉素肠球菌(VRE)的出现,引起更多人士的关注。不仅如此,菌株的分布也发生了巨大的变化。肠球菌耐药机制比较复杂,不仅对多种抗生素呈固有耐药,而且易产生获得性耐药及药物耐受等,给临床治疗带来很大的麻烦。本文首次研究了万古霉素耐药菌株粪肠球菌及其在药物诱导条件下的比较蛋白质组学。目的:通过对万古霉素耐药菌株粪肠球菌及其在药物诱导条件下的比较蛋白质组研究,了解耐万古霉素粪肠球菌在蛋白质表达上发生的各种变化,包括蛋白质表达量的变化,以及蛋白质翻译后修饰。为阐明粪肠球菌的多重耐药机制、建立有效的应对策略提供科学依据。方法:分别对耐万古霉素粪肠球菌及其药物诱导菌株,和中国人民解放军309医院ICU监护室分离的耐万古霉素粪肠球菌(Enterococcus Faecalis 309,EF309)及其药物诱导菌株采用pH3-10和pH4-7的IPG胶条进行双向电泳实验,用ImageMaster软件对得到的电泳图谱分4组(EF v583 & EFv583药物诱导pH3-10、EF v583 & EFv583药物诱导pH4-7、EF 309 & EF 309药物诱导pH3-10、EF v309 & EFv309药物诱导pH4-7)进行图像分析,比较4组药物诱导前后耐万古霉素粪肠球菌的蛋白质表达差异,取蛋白质表达量差异2.5倍以上及蛋白质表达有无的147个蛋白点进行串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)分析,对每个点采集肽质量指纹图谱,再对肽质量指纹图谱中符合系统要求的肽段进行二级测序,用Biotools软件将肽质量指纹图谱与测序图谱合并提交到本地Mascot,选择本地建立的Enterococcus Faecalis v583数据库进行查询。结果:蛋白质的质谱鉴定得到108个有意义的结果,涉及64种蛋白,所有鉴定到的蛋白平均分数达到300分以上,平均序列覆盖率达到30%以上,蛋白鉴定结果最高分909分,最高序列覆盖率92%,鉴定结果准确可靠。鉴定到的蛋白主要与糖酵解途径、三羧酸循环、氨基酸代谢、能量代谢和核苷酸代谢通路有关。鉴定到10个“假想蛋白(hypothetical protein)”,到目前为止它们的功能不明确。它们在万古霉素存在时高水平的表达,表明粪肠球菌对万古霉素的耐药性是多个蛋白共同作用的复杂机制。鉴定到耐药蛋白3个,VanA、VanB、VanX。转运蛋白2个,可能发生了修饰的蛋白7个。通过CodonW、Expasy ProtParam tool等软件对鉴定到的蛋白质和理论蛋白质在密码子偏好性、蛋白质疏水性、蛋白质功能分类、蛋白质定位等方面进行比较,结果显示二者在以上各个方面的分布情况基本一致。但也存在一个蛋白质对应电泳图中多个蛋白质点的现象,其中蛋白质VanA分别对应了两张电泳图中的共10个蛋白质斑点,蛋白质VanB对应了一张电泳图上的5个蛋白质斑点,并且VanA鉴定结果的平均分数达到618分,平均序列覆盖率达到51.4%,VanB鉴定结果的平均分数达到507分,平均序列覆盖率达到57.6%。结论: 1.构建了粪肠球菌EFv583和EF309在万古霉素药物诱导前后,不同PH梯度的双向电泳参考图谱。优化了高通量全自动的质谱鉴定方法,不仅效率高,且鉴定结果准确可靠。2.在高表达的147个取点中鉴定到108个有意义的结果涉及64种蛋白,并在国家生物医学分析中心蛋白质组学网(www.proteomics.cn)上建立了数据库。鉴定了10个“假想蛋白”,为揭示这些蛋白在粪肠球菌耐药机制中的作用提供了新线索。3.对鉴定到的蛋白进行了密码子使用偏好性分析、蛋白质功能分类、代谢通路分析、疏水性分析等。鉴定蛋白的GRAVY值显示鉴定的蛋白大部分为亲水性蛋白,有8个疏水性蛋白。鉴定蛋白大多数是细胞质内蛋白,也有2个蛋白预测定位于细胞膜,18个细胞定位未知。并且,鉴定到了1个细胞外蛋白。鉴定到了糖酵解途径、三羧酸循环、氨基酸代谢、能量代谢和核苷酸代谢通路中的各种蛋白质共计28个。4.鉴定了3个耐药蛋白:VanA、VanB、VanX。其中VanA和VanB在药物诱导后高表达,并且可能出现了翻译后修饰。重要的是在EF309中同时鉴定到了VanA和VanB,与PCR鉴定结果一致,VanA和VanB蛋白序列具有较高同源性,它们共存或许是该菌株高耐药的原因之一,VanA和VanB在EF309中可能以双耐药机制共同发挥作用。5.鉴定到了与遗传疾病以及多重耐药相关的ABC transport基因,提示ABC transport基因家族在耐万古霉素粪肠球菌的耐药机制中可能的作用,以及在耐药基因传播中可能的作用。本研究结果对揭示粪肠球菌耐药的分子机制,从而找到相应的控制策略具有重要的意义。