【摘 要】
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目的:探讨转录因子GCF2对肝癌细胞增殖和凋亡的影响,并探讨它是否通过E2F1/Cyclin A1/CDK2通路参与肝癌细胞增殖和凋亡,为后续实验打下基础。方法:（1）通过生物信息学分析GCF2 m RNA在肝细胞癌组织（HCC）和癌旁组织（ANCT）中的表达;利用免疫组化方法检测GCF2蛋白在HCC组织和ANCT组织表达。（2）根据前期实验结果选择GCF2高表达的人肝癌细胞株Hep G2用于实验
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目的:探讨转录因子GCF2对肝癌细胞增殖和凋亡的影响,并探讨它是否通过E2F1/Cyclin A1/CDK2通路参与肝癌细胞增殖和凋亡,为后续实验打下基础。方法:（1）通过生物信息学分析GCF2 m RNA在肝细胞癌组织（HCC）和癌旁组织（ANCT）中的表达;利用免疫组化方法检测GCF2蛋白在HCC组织和ANCT组织表达。（2）根据前期实验结果选择GCF2高表达的人肝癌细胞株Hep G2用于实验;并通过si RNA干扰技术将下调GCF2序列片段转入人肝癌细胞株Hep G2中。实验分为转染质粒组（GCF2-si RNA）,阴性对照组（NC-si RNA）和空白对照组（MOCK）。分别采取RT-PCR及Western blot方法检测干扰后各组细胞中GCF2的基因及蛋白的相对表达含量。（3）分别利用细胞克隆形成实验和CCK8细胞活性实验探求GCF2对Hep G2细胞克隆能力和细胞增殖的影响;（4）通过Annexin V-7AAD/PE双染法和PI单染法分别验证GCF2对Hep G2细胞凋亡及周期的影响;并利用Western blot检测GCF2对Hep G2细胞周期相关蛋白及凋亡相关蛋白的影响。结果:（1）生物信息学分析显示GCF2 m RNA在HCC组织的表达明显高于ANCT组织（p＜0.01）;免疫组化结果提示GCF2在HCC组织高表达,且主要表达于细胞浆,HCC组织的GCF2表达水平明显高于ANCT组织（p＜0.05）。（2）靶向GCF2 m RNA的si RNA有效敲低Hep G2中的GCF2m RNA和蛋白表达（p＜0.01）。（3）CCK8结果显示:GCF2下调后,GCF2-si RNA组24 h、48 h、72 h的抑制率分别为:（21.8±0.07）%、（43.6±0.08）%、（24.4±0.05）%,而NC-si RNA组分别为:（15.0±0.08）%、（25.4±0.08）%、（18.8±0.07）%,在降低GCF2表达后48 h抑制最为明显,GCF2-si RNA组明显高于NC-si RNA组（p＜0.05）;平板细胞克隆形成实验结果显示GCF2-si RNA组、MOCK组、NC-si RNA组的克隆率分别为:（25.1±2.30）%、（79.6±3.14）%、（65.8±2.43）%,在敲低GCF2表达后,GCF2-si RNA组的克隆形成能力显著低于NC-si RNA组及MOCK组（p＜0.05）。（4）细胞凋亡检测结果显示:下调GCF2表达后,GCF2-si RNA组48 h细胞的凋亡率为（11.64±1.85）%,MOCK组为:（4.3±0.89）%,NC-si RNA组为（5.2±0.38）%,GCF2-si RNA组的细胞平均凋亡率显著增加（p＜0.05）;细胞周期检测结果显示,S期百分比显著增高（p＜0.05）,G0/G1期显著减少,细胞周期阻滞在S期;在蛋白分子水平,Western blot结果显示,与MOCK组和NC-si RNA组比较,GCF2-si RNA组中细胞周期相关蛋白Cyclin A1表达量明显增多,细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2和转录因子E2F1表达量明显减少;细胞凋亡相关蛋白p21、裂解的Caspase-3的表达量均比MOCK组及NC-si RNA组高（p＜0.05）。结论:（1）GCF2在肝癌组织和肝癌细胞中高表达,提示GCF2高表达可能与肝癌的发生发展有关。（2）下调GCF2表达能使Hep G2细胞周期阻滞,抑制Hep G2细胞克隆、增殖,促进Hep G2细胞凋亡,说明GCF2可能参与肝癌发生发展的生物学行为。（3）下调GCF2引起肝癌细胞周期相关蛋白Cyclin A1表达增加、CDK2、E2F1表达减少,提示GCF2可能通过E2F1/Cyclin A1/CDK2通路影响肝癌细胞增殖和凋亡,为后续研究奠定基础。
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