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本文系统地研究了冬凌草甲素体外诱导人肿瘤细胞发生凋亡和自噬的分子机制,着重阐述了在人宫颈癌HeLa细胞,人乳腺癌MCF-7细胞和人表皮癌A431细胞中,冬凌草甲素诱导的自噬作用对凋亡途径的影响,初步探讨了冬凌草甲素诱导条件下凋亡和自噬相互关系的分子基础。实验结果表明,人宫颈癌HeLa细胞,人乳腺癌MCF-7细胞和人表皮癌A431细胞均可由冬凌草甲素体外诱导发生凋亡,且冬凌草甲素对细胞的作用具有时间、剂量依赖性,其中人表皮癌A431细胞对其敏感性最强,而人乳腺癌MCF-7细胞相对最弱。发生凋亡时,各癌细胞株均呈现出典型的凋亡特征性变化:形态学上,贴壁细胞浮起变圆、细胞核皱缩、细胞膜出泡、形成凋亡小体,Hoechst33258荧光染色强度增强而Rhodamine123荧光染色强度减弱;DNA单链断裂损伤,琼脂糖凝胶电泳出现梯状条带,且随着这种损伤的增加发生细胞周期阻滞,最终导致细胞死亡。同时,冬凌草甲素依据作用浓度而异,亦可于体外诱导上述人肿瘤细胞发生不同程度的自噬,表现为细胞对自噬特异性染料MDC(mono-dansylcadaverine)的摄入能力增强,但由冬凌草甲素诱导的自噬在凋亡途径中的影响却不尽相同。冬凌草甲素体外诱导人宫颈癌HeLa细胞发生凋亡时,抗凋亡蛋白Bcl-2,p-Bcl-2,SIRT-1和p-Akt表达下调,促凋亡蛋白Bax表达增加。自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)的使用可以显著上调上述凋亡相关蛋白的表达变化,即抗凋亡蛋白表达进一步下调,而促凋亡蛋白表达进一步增加。3-MA加强了凋亡的形态学改变,抑制自噬比率而上调细胞生长抑制率,加剧了细胞在亚二倍体时期的积累,并且细胞色素c的释放增加,Caspase-3和Caspase-9前体减少,这说明自噬作用在冬凌草甲素体外诱导人宫颈癌HeLa细胞发生凋亡的过程中是一种负调控机制。PI3K的抑制剂wortmannin可以降低自噬比率和细胞存活率,说明其促进自噬对抗凋亡的功能,是研究自噬与凋亡相互关系的重要靶点。此外,我们发现在本实验体系中磷酸化Bcl-2(p-Bcl-2)既对抗凋亡又对抗自噬,提示我们该蛋白是一个重要的调控因子。冬凌草甲素可以时间-剂量依赖性地诱导HeLa细胞发生自噬,自噬相关蛋白MAP-LC3-Ⅱ和Beclin 1的表达显著上升。3-MA对自噬的抑制作用以及对细胞的生长抑制率也是具有剂量依赖性的。小G蛋白Ras抑制自噬,蛋白激酶Raf-1对自噬影响不大。有丝分裂原激活激酶MAPKs在自噬和凋亡中都起着至关重要的作用,c-Jun N末端激酶JNK和P38激酶促进自噬,细胞外信号调节激酶ERK对自噬影响不大。值得一提的是:在冬凌草甲素的作用下,JNK和P38与ERK一样促进细胞的存活,提示我们JNK和P38在自噬和凋亡中的双向调节作用。蛋白免疫印迹进一步证明,冬凌草甲素下调磷酸化ERK(p-ERK)的表达,上调磷酸化JNK(p-JNK)和磷酸化p-38(p-P38)的表达;然而当自噬被3-MA抑制时,JNK和P38的磷酸化基因产物表达水平下降。同时,JNK和P38的抑制剂SP600125和SB203580能够显著下调由冬凌草甲素引起的自噬相关蛋白MAP-LC3-Ⅱ和Beclin 1的蛋白表达。乳酸脱氢酶的结果显示,冬凌草甲素诱导人乳腺癌MCF-7细胞死亡以凋亡的形式为主。随着冬凌草甲素剂量的增加,线粒体膜电位下降,P21表达的上调导致细胞周期阻滞于S期,非整倍体细胞数减少。促凋亡蛋白磷酸化p53(p-p53)、Bax、p-JNK、p-P38和半胱氨酸蛋白酶9(Caspase-9)的表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2、p-ERK和热休克蛋白90(Hsp90)表达下降。尤为重要的是:我们使用的人乳腺癌MCF-7细胞不同于以前的报道,它能正常表达半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的前体,但却不能剪切底物Caspase激活DNA酶抑制物质(ICAD),呈现功能缺失状态。然而,多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)却发生了降解,这是由于与Caspase-3功能相似的Calpain发挥了蛋白水解作用,Calpain的抑制剂可以部分抑制细胞的生长,说明Calpain与Caspase-9共同一起在线粒体下游促成了MCF-7细胞的凋亡。不同于HeLa细胞的是,在MCF-7细胞中,冬凌草甲素诱导的自噬可以促进凋亡的发展。当自噬作用受到3-MA的抑制后,Hoechst33258荧光染色强度减弱,凋亡细胞数减少,亚二倍体峰和S期阻滞均下调。Western blot印迹结果显示,3-MA上调了由冬凌草甲素引起的p-ERK蛋白表达的下降,同时下调了由冬凌草甲素引起的p-JNK和p-P38蛋白表达的增加。冬凌草甲素作用于人表皮癌A431细胞与作用于HeLa细胞的情况相似,冬凌草甲素诱导其发生的自噬能够拮抗凋亡。经冬凌草甲素处理的A431细胞呈现典型的凋亡特征,并伴随自噬现象的出现。自噬抑制剂3-MA可以有效阻断A431细胞自噬的发生并加速凋亡的进程,具体表现为:经3-MA预处理后,凋亡比率上升、Hoechst33258染色荧光增强、细胞S期阻滞加剧伴随sub G0/G1峰值增加,p53和p-p53免疫印迹的结果同样证实了3-MA促进冬凌草甲素诱导的A431细胞凋亡。A431细胞高表达酪氨酸蛋白激酶EGFR,自噬抑制剂3-MA可以减低细胞总PTK活力,有趣的是,它却对冬凌草甲素引起的细胞总PTK活力下降没有明显的干预。然而,EGFR却在凋亡中扮演着重要的角色。3-MA能够显著降低EGFR和p-EGFR的蛋白表达,但不影响冬凌草甲素对EGFR和p-EGFR的抑制作用,提示我们EGFR促进存活对抗凋亡的功能。综上所述,冬凌草甲素能够有效的诱导人肿瘤细胞发生自噬和凋亡,根据不同细胞类型,冬凌草甲素诱导的自噬可以通过先粒体、细胞周期等不同的信号转导途径促进或抑制凋亡的发展,从而杀死或保护细胞,是一种双向调节机制。