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目的用携带Islet-1的慢病毒感染间充质干细胞C3H10T1/2并诱导其向心肌细胞特异分化。在此条件下,通过影响Akt的活性,检测心肌早期发育相关基因的变化情况,来探讨Akt在此特化过程中是否发挥促分化的作用及机制。方法1.取生长状态以及形态良好的间充质干细胞C3H10T1/2以5×104个/T13的密度进行细胞铺瓶,待增殖融合度达到60-70﹪时,向瓶中添加带有GFP和Islet-1的慢病毒感染细胞。待慢病毒感染细胞特定时间后,利用流式细胞术对感染细胞的病毒转染效率进行检测;细胞免疫荧光对Islet-1,c Tn T和p-Akt/T-Akt蛋白的定位和表达进行检测以及采用Western-bloting对这些蛋白进行半定量测定。2.Akt特异性抑制剂MK-2206处理Islet-1慢病毒感染后的细胞,CCK-8法检测其对病毒感染后细胞增殖的影响以及采用Western-bloting对细胞Akt活性进行检测;实时荧光定量PCR对各组细胞心肌特异转录因子(Mef2c,Nkx2.5和GATA4)的m RNA时序性表达情况进行检测。结果1.经慢病毒感染的C3H10T1/2细胞培养96h后,可在镜下观察到稳定表达GFP的细胞约为90%,FCM对阴性和实验组细胞病毒转染效率的检测结果分别为89.7%和94.7%。免疫荧光和Western-bloting均检测到感染后细胞Islet-1和c Tn T蛋白的表达。2.CCK-8结果表明,MK-2206的浓度与其对细胞的生长抑制程度呈正相关;Western-bloting结果显示,其对感染后细胞Akt活性的最佳抑制浓度为8nmol/L;随着诱导分化时间的延长,感染后细胞的p-Akt/T-Akt蛋白表达逐渐降低,且在第3周最低(*P<0.05),而后开始升高;Q-PCR检测到心肌特异基因Mef2c,Nkx2.5和GATA4的m RNA表达量出现逐渐升高的趋势(*P<0.05),说明干细胞向心肌样细胞特异分化;经MK-2206处理的感染后细胞,其心肌特异基因的m RNA表达量在第1周时出现短暂明显升高后又逐渐降低(*P<0.05)。结论1.在Islet-1促间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程中,Islet-1可通过Akt调控干细胞向心肌细胞特异分化。2.Akt在Islet-1促C3H10T1/2细胞特化过程中,Akt在早期分化的起始阶段表现为抑制分化的作用,而后则表现为促进分化的作用。