【摘 要】
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菠菜（Spinacia oleracea L.）是耐寒不耐热的绿叶蔬菜,高温胁迫严重影响菠菜的生长、产量和品质。挖掘关键的菠菜耐热基因,将有助于利用分子育种策略进行菠菜耐热品种培育。然而,由于缺乏高效菠菜遗传转化体系,限制了菠菜耐热基因的功能鉴定和深入研究。我们通过筛选用于毛状根侵染的外植体提高毛状根诱导率,通过筛选毛状根的愈伤组织诱导培养基和不定芽诱导培养基优化毛状根的植株再生效率,最终建立了菠
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菠菜（Spinacia oleracea L.）是耐寒不耐热的绿叶蔬菜,高温胁迫严重影响菠菜的生长、产量和品质。挖掘关键的菠菜耐热基因,将有助于利用分子育种策略进行菠菜耐热品种培育。然而,由于缺乏高效菠菜遗传转化体系,限制了菠菜耐热基因的功能鉴定和深入研究。我们通过筛选用于毛状根侵染的外植体提高毛状根诱导率,通过筛选毛状根的愈伤组织诱导培养基和不定芽诱导培养基优化毛状根的植株再生效率,最终建立了菠菜毛状根遗传转化体系和菠菜毛状根再生体系,为菠菜基因功能研究奠定基础。主要研究结果如下:1.首先,为了提高菠菜毛状根诱导效率,对用于侵染的外植体进行筛选。选择了菠菜Sp75、Sp73的叶片和叶柄作为外植体,对毛状根诱导效率进行统计。发现Sp75叶柄的诱导效率最高,可达到22.3%;Sp75叶片仅为15.7%;Sp73叶柄和叶片的毛状根诱导率分别为10.3%和14%。2.通过在愈伤诱导培养基添加NAA、GA3激素,使得以毛状根为外植体诱导得到的愈伤组织具有胚性。通过在不定芽诱导培养基中添加6-BA、NAA、KT等激素,使以菠菜毛状根作为外植体的不定芽诱导率提高到46.7%。3.利用CRISPR/Cas9技术构建了So MBF1s敲除载体,通过菠菜毛状根遗传转化体系,成功获得So MBF1s纯合敲除突变体毛状根。mbf1c纯合突变类型包括单个A碱基插入和4个碱基缺失两种类型,mbf1b纯合突变类型包括单个C碱基缺失和4个碱基缺失两种类型。同时,利用已构建的p Cambia2300-So MBF1s-GFP载体,通过菠菜毛状根遗传转化体系,成功获得So MBF1s过表达毛状根。q RT-PCR检测So MBF1s过表达毛状根的表达量,获得5个So MBF1c过表达毛状根和5个So MBF1b过表达毛状根,其中So MBF1b表达量最高的株系OE-7约为对照毛状根的44倍,So MBF1c表达量最高的株系OE-16约为对照毛状根的45倍。4.为了更好探究So MBF1c在耐热方面的功能,对液体培养基培养10天的So MBF1c过表达毛状根、So MBF1c敲除纯合毛状根和对照毛状根,进行39℃高温处理24h。发现So MBF1c过表达毛状根的鲜重比对照毛状根的更高,而So MBF1c敲除纯合毛状根的鲜重却较对照毛状根更低。So MBF1c过表达毛状根热处理后H2O2含量较对照毛状根高,而敲除纯合毛状根的H2O2含量较对照毛状根低,表明So MBF1c能提高菠菜毛状根的耐热性。5.通过对17个物种中191种TPS蛋白进行系统发育树分析,发现TPS蛋白分为两类。菠菜有11个成员,将其主要分为两类,So TPS1-3、So TPS9-11属于Ⅰ类,So TPS4-8属于Ⅱ类。6.克隆了菠菜So TPSs基因家族中6个成员。基因结构分析发现,所有Ⅰ类So TPSs基因的内含子数量比Ⅱ类So TPSs基因内含子的数量多,Ⅱ类So TPSs基因内含子数量不超过3个,外显子数量都是3个;保守基序分析发现,II类成员拥有所有10个保守基序,而I类成员则有所缺失;染色体定位分析发现,So TPS2和So TPS3都位于4号染色体上,So TPS6和So TPS10位于3号染色体,而其他染色体上仅存在单个基因;顺式作用元件分析发现,So TPSs基因可能会在应激、激素、光反应和生长发育等方面中发挥了重要作用。上述研究结果为后续进行菠菜基因功能研究提供了基础。
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